【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于耳科学及生物医学研究领域，具体涉及一种基于新鲜取材大动物耳蜗标本的快速铺片方法。
技术介绍
1、耳蜗铺片是一种利用荧光显微镜对取材于耳蜗来源的组织，利用荧光素与目标抗原特异性结合原理进行直观、准确的显像定位的形态学研究方法。
2、常规耳蜗铺片的步骤为：取材、固定、脱钙、解剖、制片(封闭打孔、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、漂洗、dapi染色封片)。获取耳蜗内基底膜、螺旋韧带等组织是进行耳蜗铺片的关键步骤。因实验动物耳蜗被坚硬骨壳包裹，强行解剖容易损毁待观察的耳蜗组织，常规需完成脱钙后进一步处理。因实验动物种属、年龄等差异，脱钙时间相差悬殊，小鼠、豚鼠、猪耳蜗的脱钙时间大致为10小时、2天、3-4周。故而从取材到耳蜗铺片制片完成，小鼠、豚鼠、猪标本的耗时大致为4天、6天和4周左右。猪耳蜗铺片的制片用时远远长于啮齿类动物，使得研究周期大大延长。
3、现有研究证明，小型猪作为大动物模型在耳科学研究中潜力巨大，是耳科学转化医学研究中重要的工具。而且在转化医学研究中，部分实验对标本的处理时间有严格要求，如小型猪经内耳导入的示踪研究，因导入耳蜗的示踪染料或荧光标记物随着时间的延长存在荧光淬灭的可能，需要在较短时间内完成对实验动物耳蜗组织的观察。
4、现有技术尚无法解决猪等大动物耳蜗快速铺片的技术难题，成为此类研究的巨大障碍。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提出了一种用于猪等大动物耳蜗的快速铺片方法。本专利技术将大动物耳蜗铺片
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种大动物耳蜗的快速铺片方法，该快速铺片方法包括：
4、大动物耳蜗取材、固定后直接进行切割、解剖，然后进行脱钙、修剪、制片。
5、所述取材为：大动物安乐死后，取出耳蜗。
6、所述固定为：将取出的耳蜗移至体式显微镜下，自蜗顶钻孔，剔除残留听小骨，刺破镫骨，开放前庭窗，撕除圆窗膜，4％多聚甲醛固定液，自蜗顶钻孔处缓慢灌注，反复3次以上；将耳蜗放入装满4％多聚甲醛固定液的离心管中，放入4℃冰箱过夜。
7、所述切割为：取固定好的耳蜗标本，经蜗顶至卵圆窗的连线假想一垂直于蜗轴的平面，将耳蜗一分为二；获得左、右半片耳蜗各一个，其中一个半片耳蜗包含中转和底转的耳蜗组织，另一个半片耳蜗包含顶、中、底转的耳蜗组织。
8、所述解剖为：1)游离耳蜗中转组织：
9、取包含有顶、中、底转的半片耳蜗组织，在低倍体式显微镜下，找到耳蜗膜迷路中转及其上下界，沿耳蜗中底转交界处向外切断蜗轴，分离中转与底转，沿顶转中转交接处切断蜗轴，分离中转与顶转；
10、2)获取耳蜗中转组织：
11、沿耳蜗中转骨壳内侧壁采用地毯式分离，获取耳蜗中转组织；
12、3)获取耳蜗顶转组织：
13、找到耳蜗膜迷路顶转上下界，顶转的上界即蜗顶，耳蜗灌流固定时已被钻孔，蜗顶软组织与骨壳基本分离；沿耳蜗顶转骨壳内侧壁地毯式小心分离获取耳蜗顶转组织；
14、4)获取耳蜗底转组织：
15、切断耳蜗骨螺旋板，剪断螺旋韧带及基底膜，将骨螺旋板与耳蜗骨壳分离，将此片钩部耳蜗软组织取出；然后参照步骤1)、2)获取剩余耳蜗底转组织；
16、5)取包含中转和底转的半片耳蜗组织，参照1)、2)步骤分离中、底转软组织。
17、所述脱钙为：将获取的顶转、中转、底转的耳蜗软组织标本，分组置于脱钙液中，常温放置脱钙4小时。
18、所述修剪为：高倍体视显微镜下，区分顶转、中转、底转耳蜗组织，去除前庭膜、盖膜，按血管纹、螺旋韧带、骨螺旋板、蜗神经、基底膜的顺序逐一进行解剖得到多个铺片标本。
19、所述制片包括封闭打孔、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、漂洗、染色封片。
20、优选地，所述大动物为小型猪、兔、犬或猴子。
21、根据本专利技术的优选实施例，一种用于猪耳蜗的快速铺片方法，该铺片方法在将小型猪安乐死后，耳蜗取材固定后直接进行切割解剖，然后进行脱钙、制片。
22、所述方法具体包括：
23、1、取材。将猪实施安乐死，取出耳蜗。
24、2、固定。将刚取的耳蜗迅速移至体式显微镜下，用18g注射器针头自蜗顶钻孔，剔除残留听小骨，刺破镫骨，开放前庭窗，继续撕除圆窗膜。用1ml移液器枪头，吸满4％多聚甲醛固定液，自蜗顶钻孔处缓慢灌注，反复3次以上。将耳蜗放入装满4％多聚甲醛固定液的离心管中，放入4℃冰箱过夜。
25、3、切割耳蜗。取固定好的猪耳蜗标本，经蜗顶至卵圆窗的连线假想一垂直于蜗轴的平面，利用微型可调电磨机，以13000-16000r/min的转速一次性将耳蜗一分为二。获得左、右半片耳蜗各一个，其中一个半片耳蜗包含中转和底转的耳蜗组织，另一个半片耳蜗包含顶、中、底转的耳蜗组织。两半片耳蜗切缘平整，内部结构清晰、连续。切割过程中，应防止来回切割造成过多组织的损失，同时切割处给予缓慢流速的常温流水降温处理，防止切割处温度过高改变组织理化性质。
26、4、剥离基底膜、螺旋韧带、蜗神经等内耳组织。
27、(1)游离耳蜗中转组织。取包含有顶、中、底转的半片耳蜗组织，在低倍体式显微镜下，找到耳蜗膜迷路中转及其上下界，18g注射器针头沿耳蜗中底转交界处向外切断蜗轴，分离中转与底转，沿顶中转交接处切断蜗轴，分离中转与顶转。
28、(2)获取耳蜗中转组织。将18g注射器针头尖端沿斜口侧折弯呈135°，弯折长度约2mm。沿耳蜗中转骨壳内侧壁利用折弯的18g注射器针头地毯式小心分离，可获取耳蜗中转组织。
29、(3)获取耳蜗顶转组织。找到耳蜗膜迷路顶转上下界。顶转的上界即蜗顶，耳蜗灌流固定时已被钻孔，蜗顶软组织与骨壳基本分离。折弯的18g注射器针头沿耳蜗顶转骨壳内侧壁地毯式小心分离并获取耳蜗顶转组织。
30、(4)获取耳蜗底转组织。近圆窗的耳蜗底转起始段(基底膜钩部)结构与其余部分有较大差异。此部分在分离时，需持18g注射器针头切断耳蜗骨螺旋板，显微剪剪断螺旋韧带及基底膜。继续将骨螺旋板与耳蜗骨壳分离。换用折弯的18g注射器针头小心分离直至此片钩部耳蜗软组织取出。尔后参照步骤(1)、(2)所述方法获取剩余耳蜗底转组织。
31、(5)另一半片耳蜗参照(1)、(2)步骤分离中、底转软组织。
32、5、常温脱钙4小时。将获取的顶、中、底转的耳蜗软组织标本分组置于装有脱钙液(10％ edta，ph7.4)的ep管中，常温放置脱钙，以降低骨螺旋板处硬度，使铺片更为平整。约4小时后，在低倍体式显微镜下未发现明显均匀细颗粒样骨质残留，方可继续下一步操作。
33、6、修剪标本。高倍体视显微镜下，区分顶、中、底转耳蜗组织，用游丝镊去除前庭膜、盖膜，尔后结合显微剪、游丝镊、15#不锈钢手本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大动物耳蜗的快速铺片方法，该快速铺片方法包括：
2.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述取材为：
3.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述固定为：
4.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述切割为：
5.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述解剖为：
6.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述脱钙为：
7.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述修剪为：
8.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述制片包括封闭打孔、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、漂洗、染色封片。
9.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述大动物为小型猪、兔、犬或猴子。
【技术特征摘要】
1.一种大动物耳蜗的快速铺片方法，该快速铺片方法包括：
2.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述取材为：
3.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述固定为：
4.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述切割为：
5.根据权利要求1所述的快速铺片方法，其特征在于，所述解剖为：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：柳红东，郭维维，杨仕明，陈伟，高云，陈志峰，胡云，袁硕龙，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一医学中心，
类型：发明
国别省市：
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