【技术实现步骤摘要】
本公开涉及类器官培养，尤其涉及一种神经纤维瘤类器官的培养方法。
技术介绍
1、ⅰ型神经纤维瘤(nf1)疾病是一类常染色体显性遗传性疾病。神经纤维瘤是良性周围神经鞘瘤，是i型神经纤维瘤疾病最常见的临床表现。95％的患者患有皮肤型神经纤维瘤，其中30～50％的nf1患者并患有丛状神经纤维瘤(pnf)。pnf可生长巨大，压迫肿瘤周围正常组织和器官，同时10-13％具有恶变倾向，且由于与神经连接紧密，手术疗效欠佳，因此，成为当前多组学及靶向治疗研究热点。然而，神经纤维瘤为良性肿瘤，在体外研究中，与多数恶性肿瘤不同，其肿瘤细胞不具备永生性，在体外很难长久存活，难以开展研究。类器官具有在组织结构、细胞类型和功能等方面与来源组织高度一致等优点，与其他细胞系相比，其对药物敏感性、药物反应性更贴近人体反应。因此，在体外培养神经纤维瘤类器官对开展研究，寻找治疗方案具有重要意义。
2、目前，有研究者使用irb批准的手术治疗获得的人丛状神经纤维瘤，将肿瘤切成1mm3大小，转移至消化液中进行消化。然后在低吸附的24孔板中接种消化细胞，培养21天后得到神经纤维瘤类器官。然而，pnf由施万细胞、成纤维细胞、神经周围细胞和肥大细胞组成，其中施万细胞被认为是形成神经纤维瘤的起始细胞/神经纤维瘤干细胞。上述培养方法中并未进行细胞筛选，不能保证施万细胞占绝大部分，从而会影响球体的形成和增殖。此外，上述培养方法得到的肿瘤球数目稀少且体积小，多次传代稳定性差，肿瘤球数目无法满足实验需求。
3、基于此，有必要提供一种神经纤维瘤类器官的培养方法，以解
技术实现思路
1、本公开提供了一种神经纤维瘤类器官的培养方法，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
2、根据本公开的第一方面，提供了一种神经纤维瘤类器官的成球培养基，包括如下组分：dmem/f12，1～1.5％的b27，1～1.5％的n2，200～250ng/ml的egf，200～250ng/ml的fgf，0.1～0.3mm的β-me，2～3μg/ml的肝素，2.5～5μg/ml的两性霉素b，5～7μg/ml的左氧氟沙星。
3、具体地，上述成球培养基中加入了两性霉素b和左氧氟沙星两种抗生素，可有效地消除细胞培养中常见的细菌、真菌污染，为肿瘤类器官形成提供更稳定的生长环境。此外，本公开对现有的成球培养基的配方进行了改进，将生长因子egf和fgf的工作浓度各提高了10倍左右，可显著促进细胞增殖，使得到的神经纤维瘤类器官的肿瘤球的数目更多，每个肿瘤球所含有的细胞数更多，肿瘤球的体积更大。
4、在一优选的实施方式中，一种神经纤维瘤类器官的成球培养基，包括如下组分：dmem/f12(1：1)，1％的b27，1％的n2，200ng/ml的egf，200ng/ml的fgf，0.1mm的β-me，2μg/ml的肝素，2.5μg/ml的两性霉素b，5μg/ml的左氧氟沙星。
5、在一可实施方式中，所述神经纤维瘤类器官为丛状神经纤维瘤类器官。
6、根据本公开的第二方面，提供了一种神经纤维瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
7、s1：消化神经纤维瘤组织块，并制备单细胞悬液；
8、s2：将步骤s1所述单细胞悬液置于多聚赖氨酸处理的培养皿中，加入施万细胞培养基培养24小时，得施万细胞(schwann细胞)富集液；
9、s3：收集所述施万细胞富集液，并加入上述成球培养基和生长因子y-27632，培养6-12h后收集细胞，再加入所述成球培养基继续培养7～14d，得所述神经纤维瘤类器官。
10、在一可实施方式中，步骤s1消化所述神经纤维瘤组织块包括以下步骤：清洁、剪碎所述神经纤维瘤组织块，并置于消化液中进行消化，消化完成后加dmem+10％ clark培养基终止消化。
11、具体地，清洁、剪碎所述神经纤维瘤组织块具体包括如下步骤：用pbs冲洗所述神经纤维瘤组织块2～3次；然后将冲洗后的所述神经纤维瘤组织块剪成1～1.5cm3的组织块，剔除所述组织块上的额外组织，最后剪成1～1.5mm3的肉糜状组织块。
12、具体地，用所述pbs冲洗所述神经纤维瘤组织块，目的是为了洗去表面残留的培养基和血液。
13、具体地，剔除所述组织块上的额外组织，是指剔除所述组织块上的毛发、血液凝块、血管、脂肪等组织，以防造成污染。
14、具体地，所述消化液和所述神经纤维瘤组织块的使用比例为：每20～25ml所述消化液消化5～6块所述神经纤维瘤组织块。
15、具体地，所述消化液包括如下组分：l-15培养基，50～80mg/ml的庆大霉素，250～280μg/ml的两性霉素b，500～520μg/ml的左氧氟沙星，10000iu的青霉素/链霉素/氨苄青霉素(pen/strep/amp)，155～160u/ml的ⅰ型胶原酶，1.25～1.5u/ml的分散蛋白酶ⅱ。
16、更具体地，所述消化液包括如下组分：l-15培养基，50mg/ml的庆大霉素，250μg/ml的两性霉素b，500μg/ml的左氧氟沙星，10000iu的青霉素/链霉素/氨苄青霉素(pen/strep/amp)，156u/ml的ⅰ型胶原酶，1.25u/ml的分散蛋白酶ⅱ。
17、具体地，消化液中加入了两性霉素b和左氧氟沙星两种抗生素，可有效地消除细胞培养中常见的细菌、真菌污染，为肿瘤类器官形成提供更稳定的生长环境。
18、具体地，所述消化的条件包括：于35～37℃恒温摇床中消化3～3.5h，转速为180～200rpm。
19、具体地，在消化过程中可摇晃观察组织块的消化情况，待组织碎片边缘不清晰、弥散拖尾即可终止消化。
20、具体地，所述dmem+10％ clark培养基与所述消化液的体积比为1：1。
21、在一可实施方式中，步骤s1在消化所述神经纤维瘤组织块后，将组织吹散，再进行离心，弃上清液，得第一细胞沉淀。
22、具体地，所述吹散具体包括以下步骤：先用无菌巴氏吸管将组织吹散，直至没有阻力且肉眼看不到沉淀，再用1000μl枪头继续吹打数十次，至没有阻力或阻力变小。
23、在上述吹散过程中，勿剧烈吹打，以免导致细胞机械性死亡，降低原代细胞的提取效率。
24、具体地，所述离心的转速为2000～2500rpm，时间为10～15min。
25、在一可实施方式中，步骤s1还包括如下步骤：向所述第一细胞沉淀中加入新鲜的dmem+10％ clark培养基，用1000μl枪头吹打至无肉眼可见组织块后，更换玻璃管吹打，以将黏连在神经周围的施万细胞吹打下来；然后离心，弃上清液，得第二细胞沉淀；向所述第二细胞沉淀中加入施万细胞培养基，得所述单细胞悬液。
26、具体地，所述玻本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种神经纤维瘤类器官的成球培养基，其特征在于，所述成球培养基包括如下组分：DMEM/F12，1～1.5％的B27，1～1.5％的N2，200～250ng/mL的EGF，200～250ng/mL的FGF，0.1～0.3mM的β-ME，2～3μg/mL的肝素，2.5～5μg/mL的两性霉素B，5～7μg/mL的左氧氟沙星。
2.根据权利要求1所述成球培养基，其特征在于，所述神经纤维瘤类器官为丛状神经纤维瘤类器官。
3.一种神经纤维瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤S1消化所述神经纤维瘤组织块包括以下步骤：清洁、剪碎所述神经纤维瘤组织块，并置于消化液中进行消化，消化完成后加DMEM+10％Clark培养基终止消化；
5.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤S1在消化所述神经纤维瘤组织块后，将组织吹散，再进行离心，弃上清液，得第一细胞沉淀；
6.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤S2使用0.05～0.1％的多聚赖氨酸处理所述培养皿≥30min，然
7.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤S3收集所述施万细胞富集液具体包括以下步骤：消化步骤S2所述施万细胞富集液，吹打后进行离心，弃上清液，得第三细胞沉淀；
8.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，步骤S3向所述第三细胞沉淀中加入所述成球培养基和所述生长因子Y-27632重悬，并将细胞悬液转移至低吸附细胞培养板中悬浮培养6-12h；
9.一种神经纤维瘤肿瘤球的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述培养方法，其特征在于，将所述神经纤维瘤类器官消化成所述单细胞悬液具体包括以下步骤：将所述神经纤维瘤类器官的细胞悬液离心，得第五细胞沉淀，上清液单独保留；消化所述第五细胞沉淀，再进行离心，弃上清液，得第六细胞沉淀；向所述第六细胞沉淀中加入与所述第五细胞沉淀相对应的所述上清液和等体积的新鲜的成球培养基，形成所述单细胞悬液。
...【技术特征摘要】
1.一种神经纤维瘤类器官的成球培养基，其特征在于，所述成球培养基包括如下组分：dmem/f12，1～1.5％的b27，1～1.5％的n2，200～250ng/ml的egf，200～250ng/ml的fgf，0.1～0.3mm的β-me，2～3μg/ml的肝素，2.5～5μg/ml的两性霉素b，5～7μg/ml的左氧氟沙星。
2.根据权利要求1所述成球培养基，其特征在于，所述神经纤维瘤类器官为丛状神经纤维瘤类器官。
3.一种神经纤维瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤s1消化所述神经纤维瘤组织块包括以下步骤：清洁、剪碎所述神经纤维瘤组织块，并置于消化液中进行消化，消化完成后加dmem+10％clark培养基终止消化；
5.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤s1在消化所述神经纤维瘤组织块后，将组织吹散，再进行离心，弃上清液，得第一细胞沉淀；
6.根据权利要求3所述培养方法，其特征在...
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