【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及青贮饲料质量安全控制，具体涉及一种从苜蓿青贮饲料中快速分离关键目标梭菌菌株的方法。
技术介绍
1、随着人民生活水平的提高，肉蛋奶等畜禽产品的需求持续增加，稳定的饲草饲料供应是畜牧业发展的重要物质基础。
2、紫花苜蓿（ medicago satival.）是高产奶牛日粮中重要且不可或缺的组成部分，随着规模化、标准化奶牛产业的快速发展，对高品质植物性蛋白饲料的需求量越来越大，优质苜蓿已成为不可替代的保障饲草。青贮是苜蓿等饲草重要的贮藏方式之一，其基本原理是通过乳酸菌的厌氧发酵，使原料中所含的糖分变为以乳酸为主的有机酸，提高体系酸度抑制腐败微生物活动，并防止原料中养分继续被微生物分解或消耗，从而保存原料的养分。然而，苜蓿由于水分含量高、可溶性碳水化合物含量较低、缓冲能高等原因，单独青贮时极易发生由梭菌引起的丁酸发酵，降低青贮饲料的营养价值、导致病原菌增殖及毒素积累危害人和动物健康。因此，研究苜蓿青贮饲料中梭菌多样性，阐明导致苜蓿青贮过程中梭菌增殖、诱发丁酸发酵降低青贮品质的机理，开发抑制梭菌的新技术，构建安全、优质的苜蓿青贮饲料调制体系，对发展现代饲草产业具有重要意义。
3、近年来，分子生物学技术的快速发展极大地丰富了我们对青贮饲料中梭菌菌群的认识。研究人员利用变性梯度凝胶电泳、随机扩增多态性、末端限制性片断多态性、16srdna克隆文库、高通量测序等技术相继鉴定到 clostridium perfringens、
4、目前常用的亨盖特厌氧滚管技术是基于传统分离纯培养技术对青贮饲料中的梭菌菌株进行分离纯化，该技术方法虽然可以获得梭菌菌株，但存在因目的性不明确而导致费时费工的严重缺陷。
技术实现思路
1、为了解决上述缺陷，本专利技术提供了一种从苜蓿青贮饲料中快速分离关键目标梭菌菌株的方法，包括：利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析，确定青贮饲料样品中是否含有关键目标梭菌及其丰度；然后利用亨盖特厌氧滚管技术初步分离疑似梭菌菌株；再次利用高通量测序技术对疑似梭菌菌株进行混检，根据混检结果，找到对应的疑似梭菌菌株，采用亨盖特厌氧滚管技术进行进一步分离纯化，获得纯化的关键目标梭菌菌株。
2、本专利技术的方法通过利用高通量测序技术对梭菌分离源（苜蓿青贮饲料）进行细菌菌群多样性检测，可以及早摒弃不含目标梭菌的青贮饲料样品，极大减少无效的分离工作量。通过再次利用高通量测序技术对疑似梭菌菌株进行混检，可以快速摒弃阴性样品（非目标梭菌），再次减少无效的分离工作量。通过两次基于高通量测序技术的快检工作，可以极大地减低基于亨盖特厌氧滚管技术的菌株分离工作的盲目性，并节约测试成本。
3、优选地，所述方法还包括：获得纯化的关键目标梭菌菌株之后对其进行分离、纯化和鉴定。
4、优选地，所述方法还包括：在鉴定之后对菌株进行保藏。
5、优选地，所述苜蓿青贮饲料样品为苜蓿青贮饲料浸提液；优选地，所述苜蓿青贮饲料浸提液的制备方法包括：将苜蓿青贮饲料与无菌水混合后用无菌均质器处理，经过滤后制得。
6、优选地，利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析的步骤包括：将苜蓿青贮饲料浸提液离心收集菌体沉淀、提取细菌基因组dna，采用单分子实时测序技术，对细菌菌群进行16s rdna多样性分析。
7、优选地，初步分离疑似梭菌菌株的步骤包括：将含有关键目标梭菌的苜蓿青贮饲料浸提液于75~85℃水浴处理后，采用亨盖特厌氧滚管技术初步分离疑似梭菌菌株。
8、优选地，所述混检的步骤包括：将疑似梭菌菌株采用亨盖特厌氧管技术培养，然后将多株梭菌菌株的培养液混合为一个待测混检样品，提取细菌基因组dna，采用单分子实时测序技术，对疑似梭菌菌株进行混检。
9、优选地，获得纯化的关键目标梭菌菌株后，采用亨盖特厌氧滚管技术对其进行培养，取培养液离心收集菌体沉淀，提取基因组dna，根据16s rdna序列同源性分析对菌株进行鉴定。
10、优选地，所述苜蓿青贮饲料为变质苜蓿青贮饲料或未变质苜蓿青贮饲料。
11、优选地，所述苜蓿青贮饲料中添加有乳酸菌剂或蔗糖；所述乳酸菌剂中包括植物乳杆菌和布氏乳杆菌。
12、进一步，本专利技术提供了所述的方法在青贮饲料质量安全控制中的应用。
13、最优选地，所述方法包括如下步骤：
14、（1）苜蓿青贮饲料浸提液制备：取10 g经充分混匀的苜蓿青贮饲料样品装入无菌锥形瓶，于超净工作台内加入90 ml灭菌去离子水，用无菌均质器处理1 min，再通过4层无菌纱布过滤，得到青贮饲料浸提液；
15、（2）苜蓿青贮饲料细菌菌群高通量测序：浸提液在10000 rpm、4℃条件下离心15min，收集菌体沉淀。提取细菌基因组dna，采用单分子实时测序技术，对细菌菌群进行多样性分析，确定青贮饲料样品中是否含有关键目标梭菌及其丰度；
16、（3）初步分离疑似梭菌菌株：含有关键目标梭菌的苜蓿青贮饲料浸提液于80℃水浴处理10 min，灭除营养体并激活芽孢萌发。预处理后的浸提液接种于固体梭菌选择性计数培养基，采用亨盖特厌氧滚管技术在37℃条件下培养3-5 d，用接种环挑取因厌氧亚硫酸盐还原而形成的黑色或褐色菌落，即初步分离获得疑似梭菌菌株；
17、（4）疑似梭菌菌株混检：疑似梭菌菌株分别接种于液体强化梭菌培养基，采用亨盖特厌氧管技术在37℃条件下培养12-24 h，多株梭菌菌株的培养液混合为一个待测样品。提取细菌基因组dna，采用单分子实时测序技术，对疑似梭菌菌株进行混检，确定混检样品中是否含有关键目标梭菌；
18、（5）关键目标梭菌菌株分离和纯化：根据混检结果，找到对应的疑似梭菌菌株，采用亨盖特厌氧滚管技术进行进一步分离纯化，即获得纯化的梭菌菌株；
19、（6）关键目标梭菌菌株鉴定和保藏：纯化的梭菌菌株通过16s 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从苜蓿青贮饲料中快速分离关键目标梭菌菌株的方法，其特征在于，包括：利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析，确定青贮饲料样品中是否含有关键目标梭菌及其丰度；然后利用亨盖特厌氧滚管技术初步分离疑似梭菌菌株；再次利用高通量测序技术对疑似梭菌菌株进行混检，根据混检结果，找到对应的疑似梭菌菌株，采用亨盖特厌氧滚管技术进行进一步分离纯化，获得纯化的关键目标梭菌菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：获得纯化的关键目标梭菌菌株之后对其进行分离、纯化和鉴定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料样品为苜蓿青贮饲料浸提液；优选地，所述苜蓿青贮饲料浸提液的制备方法包括：将苜蓿青贮饲料与无菌水混合后用无菌均质器处理，经过滤后制得。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析的步骤包括：将苜蓿青贮饲料浸提液离心收集菌体沉淀、提取细菌基因组DNA，采用单分子实时测序技术，对细菌菌群进行16S rDNA多样性分析。
5.根据权利
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混检的步骤包括：将疑似梭菌菌株采用亨盖特厌氧管技术培养，然后将多株梭菌菌株的培养液混合为一个待测混检样品，提取细菌基因组DNA，采用单分子实时测序技术，对疑似梭菌菌株进行混检。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得纯化的关键目标梭菌菌株后，采用亨盖特厌氧滚管技术对其进行培养，取培养液离心收集菌体沉淀，提取基因组DNA，根据16SrDNA序列同源性分析对菌株进行鉴定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料为变质苜蓿青贮饲料或未变质苜蓿青贮饲料。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料中添加有乳酸菌剂或蔗糖；所述乳酸菌剂中包括植物乳杆菌和布氏乳杆菌。
10.权利要求1~9中任一项所述的方法在青贮饲料质量安全控制中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种从苜蓿青贮饲料中快速分离关键目标梭菌菌株的方法，其特征在于，包括：利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析，确定青贮饲料样品中是否含有关键目标梭菌及其丰度；然后利用亨盖特厌氧滚管技术初步分离疑似梭菌菌株；再次利用高通量测序技术对疑似梭菌菌株进行混检，根据混检结果，找到对应的疑似梭菌菌株，采用亨盖特厌氧滚管技术进行进一步分离纯化，获得纯化的关键目标梭菌菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：获得纯化的关键目标梭菌菌株之后对其进行分离、纯化和鉴定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料样品为苜蓿青贮饲料浸提液；优选地，所述苜蓿青贮饲料浸提液的制备方法包括：将苜蓿青贮饲料与无菌水混合后用无菌均质器处理，经过滤后制得。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用高通量测序技术对苜蓿青贮饲料样品中的细菌菌群进行多样性分析的步骤包括：将苜蓿青贮饲料浸提液离心收集菌体沉淀、提取细菌基因组dna，采用单分子实时测序技术，对细菌菌群进行16s rdna多样性分析。
【专利技术属性】
技术研发人员：郑明利，孟林，李钦，毛培春，田小霞，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。