本发明专利技术公开了基于RAA‑CRISPR‑Cas13a检测丁型肝炎病毒RNA的试剂盒，属于核酸的检测技术领域。为解决如何快速的检测或鉴定丁型肝炎病毒的技术问题，本发明专利技术提供一种组合物，所述组合物包括RAA引物对和crRNA，所述RAA引物对由核苷酸序列是序列3和序列7的两条单链DNA组成，所述crRNA的核苷酸序列是序列8。本发明专利技术基于CRISPR‑Cas13a核酸检测技术，最终提供用于丁型肝炎病毒RNA检测的RAA扩增引物对及靶向该靶点序列的特异性crRNA，该crRNA可通过激活Cas13a实现对丁型肝炎病毒RNA的高灵敏、高特异检测，在检测和鉴定丁型肝炎病毒领域具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及基于raa-crispr-cas13a检测丁型肝炎病毒rna的试剂盒。
技术介绍
1、一种组合物，其特征在于：所述组合物包括raa引物对，所述raa引物对由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的丁型肝炎病毒基因组rna片段的引物组成。
2、丁型肝炎病毒(hepatitis d virus，hdv)是一种单股负链rna病毒，必须依附乙肝病毒(hepatitis b virus，hbv)才能复制和传播。临床研究结果表明，hdv与hbv同时或重叠感染，可造成原有病情加重，容易发展成为重型肝炎、肝硬化、肝纤维化及肝癌，严重威胁人类健康。虽然我国属于hdv低度流行区，但由于我国人口基数大和慢性hbv感染者众多，目前估算我国hdv感染总人数占全球hdv感染人数的8.8％，同时也是全球因感染hdv而经济负担最重的国家。因此，对hdv进行及时准确的检测具有重要的临床意义。目前对于hdv的检测方法主要针对其抗原和抗体，例如酶联免疫吸附法、放射免疫法和免疫印迹法。这些方法对hdv临床样本的检测灵敏度和特异性不高，并且一致性较差，需要更精准的检测方法。
3、近年来，基于crispr-cas技术的检测方法快速发展，在生物、医学、农牧业等方面得到广泛应用。cas13a是一个rna引导的crispr效应蛋白，它能够特异性靶向切割单链rna，并在切割后仍保持活性，继续切割其他非靶标rna，这种特性被称为“附带切割”。
技术实现思路
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p>1、本专利技术要解决的技术问题是：如何快速的检测或鉴定丁型肝炎病毒。2、为解决上述技术问题，第一个方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物包括raa引物对，所述raa引物对由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的丁型肝炎病毒基因组rna片段的引物组成。
3、进一步地，所述的组合物中，所述raa引物对由核苷酸序列是seq id no.3和seqid no.7的两条单链dna组成。
4、进一步地，所述组合物还包括crrna，所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向丁型肝炎病毒rna靶点序列的向导序列。
5、进一步地，所述的组合物中，所述crrna中的所述锚定序列为seq id no.8的第1-38位，所述向导序列为seq id no.8的第39-66位。
6、进一步地，所述的组合物中，所述crrna的核苷酸序列是seq id no.8。
7、为解决上述技术问题，第二个方面，本专利技术提供用于检测丁型肝炎病毒rna的试剂盒，其所述试剂盒包括上述组合物。
8、进一步地，所述试剂盒还包括cas13a蛋白。
9、进一步地，所述的试剂盒中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。
10、进一步地，所述的试剂盒中，所述lwcas13a蛋白购自杭州众测生物科技有限公司。
11、进一步的，所述试剂盒还包括用于检测扩增产物的如下试剂中的全部或部分：ntp(如ntp mix)、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、荧光报告rna(rnase alert v2，报告rna是具有信号报告功能的rna分子)、rnase free water。
12、进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增丁型肝炎病毒rna靶点序列的缓冲液和/或ddh2o。
13、为解决上述技术问题，第三个方面，本专利技术提供如下任一物质：
14、a1、上述组合物中所述的raa引物对；
15、a2、上述组合物中所述的crrna；
16、a3、a2所述的crrna和cas蛋白，或者二者形成的复合体。
17、进一步地，上述的物质中，所述cas蛋白为cas13a蛋白。
18、进一步地，上述的物质中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。
19、为解决上述技术问题，第四个方面，本专利技术提供上述的组合物或/和上述的物质在如下任一项中的应用：
20、b1、制备用于检测丁肝病毒rna或检测丁型肝炎病毒rna的产品；
21、b2、制备用于检测或辅助检测待测样本中是否含有丁型肝炎病毒rna或制备检测或辅助检测待测样本中是否含有丁型肝炎病毒rna的产品；
22、b3、制备用于筛查目标个体是否携带丁型肝炎病毒或筛查目标个体是否携带丁型肝炎病毒的产品；
23、b4、制备用于诊断丁型肝炎或诊断丁型肝炎的产品；
24、b5、制备用于筛选或辅助筛选丁型肝炎病毒防治药物或筛选或辅助筛选丁型肝炎病毒防治药物的产品。
25、为解决上述技术问题，第五个方面，本专利技术提供一种检测或辅助检测丁型肝炎病毒rna的方法，所述方法包括使用上述的组合物或上的试剂盒检测待测样本是否为或候选为丁型肝炎病毒，或/和使用上述的组合物或上述的试剂盒检测待测样本是否含有或候选含有丁型肝炎病毒。
26、进一步地，所述的方法包括下述步骤：
27、c1)以待测样本的核酸为模板，先逆转录为cdna，再采用核苷酸序列是seq id no:3和seq id no:7的单链dna组成的引物对进行raa扩增，得到扩增产物；
28、c2)取c1)所得扩增产物作为模板，配制crispr-cas13a检测体系进行反应，所述crispr-cas13a检测体系包括权利要求1-5中任一所述组合物、cas13a蛋白、ntp、t7rna聚合酶、rna酶抑制剂；同时以水替代所述raa产物作为阴性对照；将所述体系进行荧光检测，读取检测信号，设置反应条件：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取30次；
29、c3)检测所述crispr-cas13a检测体系的荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有丁型肝炎病毒rna：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍以上，则待测样本含有或候选含有丁型肝炎病毒rna，否则待测样本不含有或候选不含有丁型肝炎病毒rna。
30、进一步地，步骤c1)中，所述raa扩增的反应条件为：39℃反应20-40分钟(如30min)。
31、进一步的，步骤c2)中，所述crispr-cas13a检测体系包括所述raa产物、上述任一所述的cas13a蛋白、上述任一所述的crrna、ntp、rna酶抑制剂、t7rna聚合酶、报告rna。
32、进一步的，步骤c3)中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取30次。
33、更进一步地，所述待测样本可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本或细胞等。
34、本专利技术所提供的检测或辅助检测丁型肝炎病毒rna的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选丁型肝炎病毒rna防治药物时检测用药前后细胞内本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括RAA引物对，所述RAA引物对由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的丁型肝炎病毒基因组RNA片段的引物组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述RAA引物对由核苷酸序列是SEQ IDNo.3和SEQ ID No.7的两条单链DNA组成。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括crRNA，所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向丁型肝炎病毒RNA靶点序列的向导序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述crRNA中，所述锚定序列为SEQ IDNo.8的第1-38位，所述向导序列为SEQ ID No.8的第39-66位。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列是SEQ IDNo.8。
6.用于检测丁型肝炎病毒RNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括Cas13a蛋白。
8.如下任一物质：
9.权利要求1-5中任一项所述的组合物或/和权利要求8所述的物质在如下任一项中的应用：
10.一种检测或辅助检测丁型肝炎病毒RNA的方法，所述方法包括使用权利要求1-5中任一所述的组合物或权利要求6或7所述的试剂盒检测待测样本是否为或候选为丁型肝炎病毒，或/和使用权利要求1-5中任一所述的组合物或权利要求6或7所述的试剂盒检测待测样本是否含有或候选含有丁型肝炎病毒。
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【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括raa引物对，所述raa引物对由特异扩增含有核苷酸序列是seq id no.1的丁型肝炎病毒基因组rna片段的引物组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述raa引物对由核苷酸序列是seq idno.3和seq id no.7的两条单链dna组成。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括crrna，所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向丁型肝炎病毒rna靶点序列的向导序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述crrna中，所述锚定序列为seq idno.8的第1-38位，所述向导序列为seq id no.8的第39-66位。
5.根据权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：任锋，张向颖，田原，徐玲，高耀，范子豪，曹亚玲，潘桢桢，段钟平，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：
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