【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫检测，具体而言，涉及一种基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统及应用。
技术介绍
1、
2、目前，病毒的常用检测方法包括通过分子扩增病毒rna的实时聚合酶链式反应(rt-pcr)和针对病毒相关蛋白的免疫测定。尽管rt-qpcr是一种灵敏且准确的方法，但它在分散的环境中面临着一些挑战，例如昂贵的热循环仪，以及较长的读取时间，需要熟练的技术。此外，rt-pcr方法无法区分活病毒或死病毒，扩增会产生假阳性率。酶联免疫吸附试验(elisa)和化学发光免疫测定等免疫测定因其能够快速特异性地筛查某些病毒而备受关注。尽管它们取得了巨大的成功，但它们有限的灵敏度阻碍了它们在疾病的及时诊断中的应用，因为有时感染的初始病毒载量很低并且难以检测到。
3、因此，为了应对上述挑战，人们越来越重视开发一些信号放大策略，以加速免疫分析的发展，例如将免疫分析信号转换成核酸信号，以实现高灵敏度的检测。目前的信令放大方法包括环介导等温扩增(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)和滚环扩增(rca)。其中，rca描述了一种单向核酸复制的过程，可以快速合成多个拷贝的环状dna/rna分子，在有限的资源中被广泛应用。但这些方法往往局限于单一病毒的检测，无法实现多靶点检测。尤其是在covid-19和流感并存的情况下，在实际应用中给社会和医务人员带来了巨大的压力。因此，开发一种高灵敏度、多靶点定量的新型免疫分析策略仍然值得期待。
4、近年来，许多研究人员致力于扩大悬浮编码策略的范围，包括荧光，量子点和光子
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的是提供一种基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统及应用，以能够实现对目标病毒的高灵敏度、高特异性的多重定量检测。
2、为此，本专利技术提供如下技术方案。
3、本专利技术的一个方面提供了一种基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，包括：
4、1)探针修饰的多孔水凝胶-phc壳微球，所述探针用于捕获待测目标核酸分子，所述多孔水凝胶-phc壳微球由多孔水凝胶包覆二氧化硅微球而成，所述多孔水凝胶-phc壳微球的直径在200～200μm之间；
5、2)dna启动子修饰的抗体；
6、3)阻断/引物复合物；以及
7、4)环状dna。
8、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤1)中，所述多孔水凝胶-phc壳微球由以下步骤制备得到：
9、在预凝胶溶液中加入光引发剂得到水凝胶溶液，所述预凝胶溶液中聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酸质量比为10～20：10～20；
10、将所得水凝胶溶液加入至二氧化硅微球中，静置，之后进行紫外光照射固化，得到水凝胶-phc壳微球；
11、将所得水凝胶-phc壳微球进行氢氟酸蚀刻，得到多孔水凝胶-phc壳微球。
12、在本专利技术的一个优选实施例中，所述引发剂选自光引发剂hmpp、光引发剂2959、光引发剂bpo中的任一种。
13、在本专利技术的一个优选实施例中，所述静置时间为1～3h。
14、在本专利技术的一个优选实施例中，所述紫外光照射条件为：波长365nm，时间20～30s。
15、在本专利技术的一个优选实施例中，所述氢氟酸浓度为0.5～1％，所述蚀刻时间为20～40min。
16、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤1)中，所述探针分别具有如seq id no：1、seqid no：2以及seq id no：3所示的核苷酸序列。
17、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤2)中，所述dna启动子修饰的抗体由dna启动子与抗体复合而成，所述dna启动子具有如seq id no：4和seq id no：5所示的核苷酸序列。
18、在本专利技术的一个优选实施例中，所述抗体包括抗sars-cov-2-n抗体、抗h1n1抗体、抗sars-cov-2-s抗体。
19、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤3)中，所述阻断/引物复合物由引物和g-padlock复合而成，所述引物用于扩增待测目标核酸分子，所述g-padlock具有如seq idno：9所示的核苷酸序列。
20、在本专利技术的一个优选实施例中，所述引物分别具有如seq id no：6、seq id no：7和seq id no：8所示的核苷酸序列。
21、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤4)中，所述环状dna单链环状dna，为滚环扩增的模板。
22、在本专利技术的一个优选实施例中，还包括：rca反应缓冲液tht、phi 29dna聚合酶。
23、本专利技术的另一个方面还提供了一种如前所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统在定性和/或定量检测h1n1、sars-cov-2-s、sars-cov-2-n中的一种或两种以上的组合中的应用。
24、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点：
25、本专利技术提出了一种新型的无标记免疫分析系统，该系统将核壳型phc条形码与rca相结合，组成基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，可用于高灵敏度和高准确度的多重病毒检测。通过大量试验结果表明，本专利技术开发的复合免疫分析系统能够实现目标物的高灵敏度和高特异性检测。
26、本专利技术的检测系统不仅表现出在同一管中同时快速准确地检测sars-cov-2-n，sars-cov-2-s和h1n1的能力，这对于h1n1、sars-cov-2-s和sars-cov-2-n的多重无标记检测具有重要价值，而且还基于dna修饰的抗体复合物结合阻断/引物复合物和rca策略将目标蛋白的信号转换为核酸信号。结果显示，该系统实现了高灵敏度的多重定量检测，检测限在0.030pg/ml范围内。此外，利用本专利技术的检测系统通过临床样本分析进行了验证，具有可接受的准确度和高特异性，证明了所提出的检测方法在临床筛查和诊断中具有良好的潜在适用性因此，这种创新系统及对应的检测方法有望在许多实际临床应用中实现对其他致病病毒和细菌的多重定量和/或定性检测。
27、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。
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1.一种基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤1)中，所述多孔水凝胶-PhC壳微球由以下步骤制备得到：
3.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述引发剂选自光引发剂HMPP、光引发剂2959、光引发剂BPO中的任一种。
4.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述静置时间为1～3h。
5.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述紫外光照射条件为：波长365nm，时间20～30s。
6.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述氢氟酸浓度为0.5～1％，所述蚀刻时间为20～40min。
7.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于
8.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤2)中，所述DNA启动子修饰的抗体由DNA启动子与抗体复合而成，所述DNA启动子具有如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述抗体包括抗SARS-COV-2-N抗体、抗H1N1抗体、抗SARS-CoV-2-S抗体。
10.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤3)中，所述阻断/引物复合物由引物和G-padlock复合而成，所述引物用于扩增待测目标核酸分子，所述G-padlock具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述引物分别具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
12.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤4)中，所述环状DNA单链环状DNA，为滚环扩增的模板。
13.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，还包括：RCA反应缓冲液ThT、Phi 29DNA聚合酶。
14.权利要求1至13中任一项所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统在定性和/或定量检测H1N1、SARS-CoV-2-S、SARS-CoV-2-N中的一种或两种以上的组合中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤1)中，所述多孔水凝胶-phc壳微球由以下步骤制备得到：
3.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述引发剂选自光引发剂hmpp、光引发剂2959、光引发剂bpo中的任一种。
4.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述静置时间为1～3h。
5.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述紫外光照射条件为：波长365nm，时间20～30s。
6.根据权利要求2所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，所述氢氟酸浓度为0.5～1％，所述蚀刻时间为20～40min。
7.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤1)中，所述探针分别具有如seq id no：1、seq id no：2以及seq idno：3所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的基于核壳光子条形码集成滚环扩增的非标记多重免疫检测系统，其特征在于，步骤2)中，所述dna启动子修饰的抗体由dna启动子与抗体复合而成，所述dna启动子具有如...
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