【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测领域，具体涉及一种新型bcr/abl融合基因荧光原位杂交探针及其制备方法。
技术介绍
1、根据髓性白血病中国诊断与治疗指南(2020年版)：慢性髓性白血病(chronicmyelocytic leukemia，cml)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％，全球年发病率为1.6/10万～2/10万。我国1986至1988年在全国22个省(市、自治区)46个调查点进行的全国白血病发病情况调查显示cml的年发病率为0.36/10万。此后国内几个地区的流行病学调查显示cml的年发病率为0.39/10万～0.55/10万。中国cml患者较西方更为年轻化，国内几个地区的流行病学调查显示cml中位发病年龄为45～50岁，而西方国家cml的中位发病年龄为67岁。
2、一代酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，tki)伊马替尼作为一线治疗药物使cml患者的10年生存率达85％～90％，尼洛替尼、达沙替尼等二代tki一线治疗cml能够获得更快更深的分子学反应，逐步成为cml患者的一线治疗方案之一。目前愈来愈多的临床研究数据表明，tki治疗获得持续的深度分子学反应(deep molecular response，dmr)超过2年的患者，部分能够获得长期的无治疗缓解(treatment free remission,tfr)，即功能性治愈。尽快获得完全细胞遗传学反应(complete cytogenetic response，ccyr)以及更深的分子学反应是c
3、bcr/abl1的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)探针可用于诊断慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，cml)以及病程观察，是血液病理中最常用的fish诊断试剂之一。22q11的bcr基因和9q34的abl1基因发生重组形成融合基因，在95％的cml患者中能检测到此融合基因。bcr/abl1融合基因表达一种异常激活的酪氨酸激酶，此激酶通过抗细胞凋亡作用而使细胞生长失控。动物实验也显示该融合基因可引起类似于cml的病变，提示其在cml等白血病的发病中起十分重要的作用。bcr/abl1易位阳性的白血病患者可以用酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼进行有效的靶向治疗。因此，检测bcr-abl1易位对于临床诊断和治疗都具有重要意义。使用fish对骨髓或外周血标本的bcr-abl1阳性细胞数进行定量还有助于临床病程的监测和微小残留病的检测。
4、检测意义：1)辅助诊断：t(9；22)(q34；q11)易位形成的bcr/abl融合基因是cml的标志物，95％的cml患者可检测出典型的t(9；22)(q34；q11)易位，约5％的cml患者通过核型分析难以检测到ph染色体，但可检测出融合基因存在，仍被归为ph+cml分类。2)指导用药：对初诊患者进行bcr/abl检测，可以进行酪氨酸激酶抑制剂(包括imatinib/dasatinib/nilotibib等)受益人群筛查。2001年5月美国食品药物管理局批准伊马替尼以商品名格列卫(glivec)(甲磺酸伊马替尼片)上市。格列卫可用于治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病(ph+cml)的慢性期、加速期或急变期。3)治疗监测：ph染色体存在于cml的整个病程中，治疗缓解后，仍持续存在，只有消除ph阳性克隆，才能达到最终治愈。《慢性髓性白血病治疗专家共识(2010版)》中强调cml治疗需达到细胞遗传学甚至分子学反应。fish方法是监测细胞遗传学反应的重要方法，在治疗期间可实时反映患者体内bcr/abl融合基因细胞量的动态变化，用于后续的治疗方案选择及药物使用效果评估。
5、同时根据中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(完整版)：
6、急性白血病的20％～30％，目前国际上有比较统一的诊断标准和不同研究组报道的系统治疗方案，完全缓解(cr)率可达70％～90％，3～5年无病生存(disease-freesurvival,dfs)率达30％～60％；美国癌症综合网(nccn)于2012年首次公布了(acutelymphoblastic leukemia，all)的诊断治疗指南，我国于2012年发表我国第1版成人all诊断与治疗的专家共识，得到了国内同行的认可。最近2016版who造血与淋巴组织肿瘤分类发表，对于all的分类有一些更新，提出了一些新概念；nccn对于成人all的临床指南也先后几次修改。基于此，对我国成人all诊断与治疗的专家共识进行了更新。bcr-abl1样all(bcr-abl1-like all)也是急性白血病主要分型之一。
7、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)技术是一种应用荧光物质标记的靶点特异性核苷酸片段－探针，依据变性，复性，双链互补的原理，在细胞核染色体上显示序列位置的方法。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，是临床分子病理诊断的技术方法之一，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、产前诊断等领域。
8、传统探针制备方法采用细菌质粒或噬菌体重组人工基因组(bac或pac)克隆，经细菌培养扩增分离的方法，提取含有靶点序列的人基因组dna片段的bac或pac克隆dna，然后以此为模板，采用聚合酶缺口平移或链式反应pcr(随机引物法)两种方法的进行荧光标记，制备成探针。以bac克隆为模板，使用缺口平移技术进行探针生产，是目前国内外探针产品的主流，为第一代探针。这类探针的主要缺点是含有重复序列和非特异性序列，重复和非特异性序列是杂交背景和非特异性信号的来源，需要富含人类基因组重复序列的cot 1dna抑制背景和非特异性信号，增加了探针生产成本。同时，cot 1dna的抑制能够极大程度地降低杂交背景，但背景仍然较高，且无法完全消除非特异性信号。另外，这类探针的大小不等，探针片段从50bp到1000bp以上，细胞或组织穿透性不均，从而造成杂交效率等不平衡。不含重复序列的探针也是以bac克隆为模板，通过pcr技术扩增后，与cot 1dna混合，经变性复性及双链特异性dna水解酶的处理，去除重复序列，然后进行荧光标记。不含重复序列探针是对传统探针本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型BCR/ABL融合基因原位杂交探针制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)PCR扩增步骤可分两步扩增，第一步扩增目的为获得多拷贝的BCR、ABL基因的探针模板库，使用不含荧光标记的正向、反向引物进行扩增获得，可通过调整扩增次数达到目的浓度；第二步扩增目的为获得单次使用的荧光探针，以探针模板库为模板，使用含有荧光标记的正向、反向引物进行扩增获得ABL、BCR基因的原位杂交荧光探针；所述探针模板库可保存重复利用。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)用于扩增探针模板库的引物为，SEQID:1所示的正向引物与SEQ ID:2所示的反向引物、SEQ ID:3所示的正向引物与SEQ ID:4所示的反向引物、SEQ ID:5所示的正向引物与SEQ ID:6所示的反向引物、SEQ ID:7所示的正向引物与SEQ ID:8所示的反向引物、SEQ ID:9所示的正向引物与SEQ ID:10所示的反向引物、SEQ ID:11所示的正向引物与SEQ ID:12所示的反向引物、SEQ ID:13所示的正向引
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)用于扩增探针模板库的引物为SEQID:21所示的正向引物与SEQ ID:22所示的反向引物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增体系采用的高保真酶为Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在，步骤(2)获得的寡核苷酸序列在应用于步骤(3)前可经过一次筛选，去除序列中包含TTTT、AAAA的寡核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)获得的寡核苷酸序列的长度在60-100bp。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中标记BCR基因的荧光染料为Fluorescein，标记ABL基因的荧光染料为Alexa，在标记体系中，20uM浓度引物用量为7.5μL每50μL体系。
9.一种新型BCR/ABL融合基因荧光原位杂交探针，其特征在于，采用如权利要求1～8任一项所述方法制备，还包含溶解探针使用的杂交液、染色液，所述杂交液含有质量百分比30-60％甲酰胺，1g-3g/10ml的硫酸葡聚糖，所述染色液含有成份DAPI和1，4-重氮二环(2，2，2)辛烷(DABCO)和对苯二胺及没食子酸丙酯作为抗淬灭剂。
10.特异性扩增引物在BCR/ABL融合基因荧光原位杂交探针制备中提高所获得的探针靶标后荧光效果的作用，所述特异性扩增引物对序列为SEQ ID:21所示的正向引物与SEQID:22所示的反向引物。
...【技术特征摘要】
1.一种新型bcr/abl融合基因原位杂交探针制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)pcr扩增步骤可分两步扩增，第一步扩增目的为获得多拷贝的bcr、abl基因的探针模板库，使用不含荧光标记的正向、反向引物进行扩增获得，可通过调整扩增次数达到目的浓度；第二步扩增目的为获得单次使用的荧光探针，以探针模板库为模板，使用含有荧光标记的正向、反向引物进行扩增获得abl、bcr基因的原位杂交荧光探针；所述探针模板库可保存重复利用。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)用于扩增探针模板库的引物为，seqid:1所示的正向引物与seq id:2所示的反向引物、seq id:3所示的正向引物与seq id:4所示的反向引物、seq id:5所示的正向引物与seq id:6所示的反向引物、seq id:7所示的正向引物与seq id:8所示的反向引物、seq id:9所示的正向引物与seq id:10所示的反向引物、seq id:11所示的正向引物与seq id:12所示的反向引物、seq id:13所示的正向引物与seq id:14所示的反向引物、seq id:15所示的正向引物与seq id:16所示的反向引物、seqid:17所示的正向引物与seq id:18所示的反向引物、seq id:19所示的正向引物与seq id:20所示的反向引物、seq id:21所示的正向引物与seq id:22所示的反向引物、seq id:23所示的正向引物与seq id:24所示的反向引物、seq id:25所示的正向引物与seq id:26所示的反向引物、seq id:27所示的正向引物与seq id:28...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛力泉，徐添明，杨帆，
申请(专利权)人：绍兴金箓生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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