【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于呈味核苷酸生产领域，特别是涉及一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法。
技术介绍
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技术介绍
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1、i+g是以5'-肌苷酸(imp)与5'-鸟苷酸(gmp)按1：1混合而成的具有呈味作用的新一代的食品增鲜剂，被广泛的应用于食品加工领域。核苷磷酸化酶(nucleosidephosphorylase)是嘌呤生物合成补救途径中能够对核苷或脱氧核苷的可逆磷酸化催化的一种关键酶，酶催化法生产i+g不会用到价格昂贵的化学试剂，并且具有专一性强，操作过程简单，反应条件温和等显著优点逐步有替代化学合成法生产i+g趋势。
2、优良的生产菌株是发酵产酶的先决条件，但如果想进一步提高酶活，还需探索适宜的产酶发酵工艺，既要考虑菌体的生长需求，还要兼顾到酶活的提高。目前，利用大肠杆菌工程菌合成核苷磷酸化酶的过程中，受代谢途径的影响，底糖浓度、溶氧控制、流加糖配比与加糖速率以及诱导温度等设计不尽合理，导致制备得到的核苷磷酸化酶酶活性不理想，无法满足i+g转化过程对酶活的质量要求。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、为进一步提高核苷磷酸化酶的酶活性，本专利技术以特异性菌株大肠杆菌工程菌为生产菌株，通过控制底糖浓度、溶氧控制、流加糖配比与加糖速率以及诱导温度实现核苷磷酸化酶酶活的提升，提供一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法。
2、本专利技术由如下技术方案实施：一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，将活化后的大肠杆菌工程菌接入种子培养基中进行一级菌种培养，然
3、加糖速率是影响大肠杆菌工程菌生长和产酶的关键因素。加糖速率过高，培养基中葡萄糖含量较高，此时优先利用葡萄糖导致只生长不产酶或产酶活力低；加糖速率过低，菌株在缺乏葡萄糖情况下利用乳糖，会出现只诱导产酶而生长受抑制。因此，需要配合工艺条件控制加糖速率，平衡菌体生长和产酶的关系。
4、流加糖前培养基中碳源为葡萄糖，通过控制37℃可以提高耗糖速率和生长速率，缩短发酵制酶周期。流加糖后培养基中有乳糖存在，选择合适的诱导温度能保证菌体代谢和产酶活力的提升。流加糖加入培养基中后，培养基中会有乳糖存在，此时通过温度控制进行乳糖诱导产酶。在发酵过程中诱导温度过高，一方面会使细胞内的酶活性加强，生长代谢加快，导致生长不受控制；另一方面诱导温度较高，会引起产生的核苷磷酸化酶酶活降低或甚至失活。因此，本专利技术选择将诱导温度控制在20-35℃之间保证生长和产酶均能达到预期效果。
5、进一步，流加糖中所述葡萄糖与所述乳糖的浓度比为60g/l：30g/l-30g/l：60g/l。
6、进一步，所述大肠杆菌工程菌的基因组成中含有编码磷酸转移酶突变体的dna分子，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.4或seq id no.6所示。
7、进一步，所述dna分子的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示。
8、进一步，所述大肠杆菌工程菌表达磷酸转移酶突变体，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.4或seq id no.6所示。
9、本专利技术大肠杆菌工程菌株为乳糖操纵子，当培养基中有葡萄糖时，菌株会优先利用葡萄糖，产生的代谢产物抑制腺苷环化酶，激活磷酸二酯酶，使胞内camp减少不能与cap结合，cap无法结合到lacp上游的cap结合位点，不能促进rna聚合酶和启动子结合，导致不能转录。随着培养基中葡萄糖耗尽，培养基中的乳糖会与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白无法与操纵子结合，这时rna聚合酶能与启动子结合正常转录表达核苷磷酸化酶。
10、本专利技术的优点：
11、本专利技术以特异性菌株大肠杆菌工程菌为生产菌株，通过控制底糖浓度、溶氧控制、流加糖配比与加糖速率以及诱导温度实现核苷磷酸化酶酶活的提升，酶活可达到500u/g以上。能够满足i+g转化过程对酶活的质量要求。
12、本专利技术方法简单易行，能稳步提升核苷磷酸化酶的活性，能够显著提高i+g的转化和提取工艺指标，为i+g大规模的工业生产奠定了基础。
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1.一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，将活化后的大肠杆菌工程菌接入种子培养基中进行一级菌种培养，然后将培养得到的一级菌种按比例接入发酵培养基中发酵培养，制备得到核苷磷酸化酶酶液；发酵培养过程中，流加糖前培养温度为37℃，当底糖耗尽后进行流加糖，流加糖中葡萄糖与乳糖总浓度为90g/L，流加糖加糖速率控制在225-325ml/h，流加糖后诱导温度为25-32℃，发酵过程溶氧为20-40％。
2.根据权利要求1所述的一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，流加糖中所述葡萄糖与所述乳糖的浓度比为60g/L：30g/L-30g/L：60g/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌的基因组成中含有编码磷酸转移酶突变体的DNA分子，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求3所述的一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3或SEQ
5.根据权利要求1所述的一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌表达磷酸转移酶突变体，所述磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ IDNo.6所示。
...【技术特征摘要】
1.一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，将活化后的大肠杆菌工程菌接入种子培养基中进行一级菌种培养，然后将培养得到的一级菌种按比例接入发酵培养基中发酵培养，制备得到核苷磷酸化酶酶液；发酵培养过程中，流加糖前培养温度为37℃，当底糖耗尽后进行流加糖，流加糖中葡萄糖与乳糖总浓度为90g/l，流加糖加糖速率控制在225-325ml/h，流加糖后诱导温度为25-32℃，发酵过程溶氧为20-40％。
2.根据权利要求1所述的一种提高核苷磷酸化酶酶活力的方法，其特征在于，流加糖中所述葡萄糖与所述乳糖的浓度比为60g/l：30g/l-30g/l：60g/l。
3.根据权利要求1所述的一种提高核苷磷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔凡明，玉晴，吴涛，高鹏，常利斌，龚华，李岩，赵津津，
申请(专利权)人：通辽梅花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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