【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地涉及一种il-2突变体及其应用。
技术介绍
1、il-2在免疫效应细胞激活的过程中发挥着至关重要的作用。人il-2的前体有153个氨基酸，切除n端20个氨基酸后形成成熟的分泌性il-2。t细胞在体内外的激活和增殖都依赖il-2与其相应的细胞表面受体结合后进一步激活下游的信号通路。il-2的受体包括il-2rα(cd25)、il-2rβ(cd122)和il-2rγ(cd132)3个亚基。il-2rα单独与il-2的亲合力较低，il-2rβγ二聚体与il-2具有中等亲和力，而il-2rαβγ三聚体与il-2的亲合力最高。cd25通常在免疫抑制性调节性t细胞(treg)表面高表达。因此，在低浓度条件下，il-2不仅激活淋巴细胞的功能较小，而且由于优先结合treg表面的高水平表达的受体il-2rα，还会优先扩增抑制性的treg细胞。为了克服这一问题，通常在临床上对患者施用较高浓度的il-2以达到激活免疫效应细胞的效果。而在高浓度的il-2在临床上通常会引发疼痛、高烧、恶心、呕吐、肺水肿，严重时会导致死亡。
2、解决上述问题的方法之一是降低甚至阻断il-2与il-2rα的结合，减少il-2对调节性t细胞的刺激，更进一步还可以同时提升il-2对il-2rβ亚基的亲合力，促进il-2对细胞毒性淋巴细胞如t细胞的激活和促进其增殖。为实现这一目的，已经有一些针对il-2序列的突变体设计，使il-2具有选择性亲合力，使其与il-2rα结合降低甚至消除，而优先结合中等亲合力受体il-2rβγ，以优先扩增和激活免疫
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供il-2突变体，使il-2具有选择性亲合力，从而优先扩增和激活免疫效应细胞，减少treg细胞的扩增和活化。
2、本专利技术提供il-2的突变体蛋白，其与对照相比具有改变的与il-2r的亲合力，并且与所述对照的序列相比，所述突变体蛋白具有至少一个氨基酸突变。
3、在一个或多个实施方案中，所述对照的序列如seq id no:55所示或与其有至少90％序列相同性的序列；或者，所述对照的序列如seo id no:55所示并且包含c125s突变，或所述对照的序列与其有至少90％序列相同性的序列但包含c125s突变。
4、在一个或多个实施方案中，所述突变位点包含选自以下的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个：e15、l19、r38、f42、p65、h79、r81、p82、r83、s87、e95、d109。
5、本专利技术第一方面提供的il-2突变体蛋白相比所述对照具有降低或消除的与il-2rα的亲合力，所述突变包含选自以下的1、2、3或4个位点的突变：r38、f42、p65、d109。在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下任一组的位点的突变：
6、(1)r38，
7、(2)r38和p65，
8、(3)f42和p65，
9、(4)p65和d109，
10、(5)r38、f42和p65。
11、在一个或多个实施方案中，所述突变包含位于r38的突变；所述突变任选还包括选自以下的1、2或3个位点的突变：f42、p65、d109。
12、在一个或多个实施方案中，所述突变包含位于r38和p65的突变；所述突变任选还包括选自以下的1或2个位点的突变：f42、d109。
13、在一个或多个实施方案中，所述突变包含位于f42和p65的突变；所述突变任选还包括选自以下的1或2个位点的突变：r38、d109。
14、在一个或多个实施方案中，所述突变包含位于p65和d109的突变；所述突变任选还包括选自以下的1或2个位点的突变：r38、f42。
15、在一个或多个实施方案中，所述突变包含位于r38、f42和p65的突变；所述突变任选还包括d109的突变。
16、在一个或多个实施方案中，所述突变体蛋白具有选自以下的一个或多个特征：
17、所述r38的突变选自：r38d、r38e、r38m、r38t、r38p、r38n、r38i、r38s、r38w、r38k、r38l、r38f；
18、所述f42的突变选自：f42k、f42a；
19、所述p65的突变选自：p65r、p65w、p65i、p65h、p65v；
20、所述d109的突变选自：d109k、d109t、d109s。
21、在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下任一组的突变：
22、(1)r38e；
23、(2)r38的突变和p65w，所述r38的突变选自：r38m、r38d、r38t、r38p、r38n、r38i、r38s、r38k、r38e、r38f；任选还包括：(a)f42k和f42a中任一突变，和/或，(b)p65r、p65w、p65i、p65h和p65v中任一突变，
24、(3)r38w和p65i；任选还包括：(a)f42k和f42a中任一突变，和/或，(b)p65r、p65w、p65i、p65h和p65v中任一突变，
25、(4)r38d和p65h；任选还包括：(a)f42k和f42a中任一突变，和/或，(b)p65r、p65w、p65i、p65h和p65v中任一突变，
26、(5)f42的突变和p65r，所述f42的突变选自：f42k、f42a，
27、(6)p65w和d109的突变，所述d109的突变选自：d109k、d109t、d109s，
28、(7)r38d、f42k和p65r；任选还包括d109k、d109t和d109s中任一突变，
29、(8)r38l、f42k和p65w；任选还包括d109k、d109t和d109s中任一突变，
30、(9)r38w、f42k和p65v；任选还包括d109k、d109t和d109s中任一突变。
31、在一个或多个实施方案中，所述il-2的突变体蛋白还包括选自以下的一个或多个位点处的突变：k35、t37、t41、k43、y45、l72。优选地，所述k35点突变是k35d；所述t37点突变是t37e；所述t41点突变是t41e；所述k43点突变是k43e；所述y45点突变是y45k；所述l72点突变是l72f。在一个或多个实施方案中，所述il-2的突变体蛋白还包括如下突变：k35d、t37e、t41e、k43e、y45k、l72f。
32、本专利技术第二方面提供的il-2突变体蛋白相比对照具有提高的与il-2rβγ的亲合力，所述突变至少包含选自以下的1、2、3、4、5、6、7或8个位点的突变：e15、l19、h79、r81、p82、r83、s87、e95。
33、在一个或本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.IL-2的突变体蛋白，其与对照相比具有改变的与IL-2R的亲合力，并且与所述对照的序列相比，所述突变体蛋白具有至少一个氨基酸突变，
2.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述IL-2突变体蛋白相比所述对照具有降低或消除的与IL-2Rα的亲合力，所述突变包含选自以下的1、2、3或4个位点的突变：R38、F42、P65、D109，
3.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述IL-2突变体蛋白相比对照具有提高的与IL-2Rβγ的亲合力，所述突变至少包含选自以下的1、2、3、4、5、6、7或8个位点的突变：E15、L19、H79、R81、P82、R83、S87、E95，
4.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述IL-2突变体蛋白包含：(1)相比所述对照具有降低或消除的与IL-2Rα的亲合力的第一突变，第一突变是选自以下的1、2、3或4个位点的突变：R38、F42、P65、D109，和(2)相比所述对照具有提高的与IL-2Rβγ的亲合力的第二突变，第二突变是选自以下的1、2、3、4、5、6、7或8个位点的突变：E15、L19
5.如权利要求1-4中任一项所述的突变体蛋白，其特征在于，所述IL-2的突变体蛋白还包括选自以下的一个或多个位点处的突变：K35、T37、T41、K43、Y45、L72，
6.一种融合蛋白，包含免疫球蛋白Fc和
7.一种核酸分子，包含选自以下的序列：
8.一种核酸构建物，所述核酸构建物包含本文任一实施方案所述的核酸分子，
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
10.一种培养基，包含权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体蛋白或权利要求6所述的融合蛋白，和/或，表达和/或分泌所述的IL-2突变体蛋白和/或融合蛋白的细胞，
11.如权利要求10所述的培养基，其特征在于，所述培养基是种子细胞培养基；优选地，是TIL的种子细胞培养基，包括以下的组分：基础培养基、细胞因子和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞因子包括权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体蛋白和/或权利要求6所述的融合蛋白，所述免疫检查点包括：PD-1、LAG-3、TIGIT和/或CTLA-4，
12.一种制备肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的方法，其包括以下的步骤：在权利要求10所述的培养基中培养分离的肿瘤浸润淋巴细胞，
13.由权利要求12所述的方法制备获得的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群。
14.权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体蛋白和/或权利要求6所述融合蛋白在制备免疫效应细胞培养基或含有活化的免疫效应细胞的药物中的应用，
15.一种培养或扩增免疫效应细胞的方法，包括用权利要求10或11所述培养基孵育所述免疫效应细胞；
16.一种制备TIL细胞群的方法，包括：
17.一种TIL细胞群，其由权利要求15所述的方法制备获得。
18.权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体蛋白和/或权利要求6所述的融合蛋白在免疫效应细胞培养中的应用，
19.(1)权利要求13所述的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群，和/或(2)权利要求17所述的TIL细胞群，在制备治疗癌症的药物中的应用，
20.一种药物组合物，包括(1)权利要求13所述的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群，和/或(2)权利要求17所述的TIL细胞群，以及药学上可接受的辅料。
21.一种用于活化免疫效应细胞的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体蛋白和/或权利要求6所述的融合蛋白，
...【技术特征摘要】
1.il-2的突变体蛋白，其与对照相比具有改变的与il-2r的亲合力，并且与所述对照的序列相比，所述突变体蛋白具有至少一个氨基酸突变，
2.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述il-2突变体蛋白相比所述对照具有降低或消除的与il-2rα的亲合力，所述突变包含选自以下的1、2、3或4个位点的突变：r38、f42、p65、d109，
3.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述il-2突变体蛋白相比对照具有提高的与il-2rβγ的亲合力，所述突变至少包含选自以下的1、2、3、4、5、6、7或8个位点的突变：e15、l19、h79、r81、p82、r83、s87、e95，
4.如权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于，所述il-2突变体蛋白包含：(1)相比所述对照具有降低或消除的与il-2rα的亲合力的第一突变，第一突变是选自以下的1、2、3或4个位点的突变：r38、f42、p65、d109，和(2)相比所述对照具有提高的与il-2rβγ的亲合力的第二突变，第二突变是选自以下的1、2、3、4、5、6、7或8个位点的突变：e15、l19、h79、r81、p82、r83、s87、e95，
5.如权利要求1-4中任一项所述的突变体蛋白，其特征在于，所述il-2的突变体蛋白还包括选自以下的一个或多个位点处的突变：k35、t37、t41、k43、y45、l72，
6.一种融合蛋白，包含免疫球蛋白fc和
7.一种核酸分子，包含选自以下的序列：
8.一种核酸构建物，所述核酸构建物包含本文任一实施方案所述的核酸分子，
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
10.一种培养基，包含权利要求1-5中任一项所述的il-2突变体蛋白或权利要求6所述的融合蛋白，和/或，表达和/或分泌所述的il-2突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：金华君，何周，黄晨，
申请(专利权)人：上海君赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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