【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞的诱导及培养。更具体地，涉及一种高效诱导调节性b细胞的体系、方法及其应用。
技术介绍
1、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)是造血干细胞移植后出现的多系统损害(皮肤、食管、胃肠，肝脏等)全身性疾病，是导致术后非复发死亡的主要原因。目前，临床用药主要依赖于糖皮质激素和免疫抑制剂，但是其治疗效果不佳，长期使用会出现感染等不良反应。
2、近年来的研究发现，过继性输注具备免疫调节或再生性能的细胞可以有效的预防和治疗gvhd。调节性b细胞(regulatory b cells，bregs)是一类具有免疫抑制能力的细胞，其可以抑制效应t细胞增殖及炎症因子分泌，诱导调节性t细胞(regulatory t cells，tregs)产生，在自身免疫性疾病、感染及移植相关疾病中都发挥了免疫耐受的作用。另有研究发现，bregs与gvhd的疾病发生发展密切相关；造血干细胞移植后与未发病患者相比，gvhd患者外周血bregs的数量明显降低；缺乏bregs显著增加小鼠gvhd的严重程度；含有bregs的脐带血与造血干细胞共同移植能够有效地降低患者gvhd的发生率；gvhd患者治疗后症状改善的同时伴随着bregs比例的上升。而过继性输注小鼠bregs可以有效改善小鼠gvhd。因此，细胞治疗可能是未来防治gvhd的有效手段。
3、b细胞在健康人外周血单个核细胞中仅占5～15％，bregs的占比则更少，人外周血中bregs占b细胞的比例不足1％，难以通过分离获得满足治疗需求的b
技术实现思路
1、本专利技术针对上述技术的缺陷和不足，提供了一种高效诱导调节性b细胞的体系、方法及其应用。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种用于诱导调节性b细胞的体系。
3、本专利技术的第二个目的是提供所述体系在诱导调节性b细胞或在制备用于诱导调节性b细胞的制剂中的应用。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种体外诱导和分选cd19+cd1c+b细胞的方法。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术针对调节性b细胞在外周血中比例较低，难以通过分离获得满足治疗需求的调节性b细胞；b细胞体外扩增困难，易于凋亡；以及目前的诱导方案不能产生足够数量的调节性b细胞，且促进il-10增加的同时也诱导了tnf-α的产生等问题，提供了一种用于诱导调节性b细胞的体系。利用本专利技术所述体系可以在高效诱导il-10+b细胞的同时降低其tnf-α的分泌。同时，本专利技术利用高维多色流式检测诱导所得的调节性b细胞表型发现，诱导的调节性b细胞高表达cd1c，且与cd19+cd1c-b细胞相比，cd19+cd1c+b细胞表达更高水平的il-10，即利用本专利技术所述体系可以诱导获得表达更高水平的il-10的调节性b细胞。此外，利用本专利技术所述体系诱导获得的cd19+cd1c+b细胞可以抑制pbmc的增殖，降低效应t细胞炎症因子的释放，用于治疗gvhd。因此，本专利技术请求保护所述诱导调节性b细胞的体系、方法及其应用。
7、本专利技术提供了一种用于诱导调节性b细胞的体系，所述体系包括基础培养基和诱导物，所述诱导物包括cpg，还包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)和/或chir-99021；所述cpg的序列如seq id no.1所示。
8、优选地，所述诱导物为cpg、间充质干细胞和chir-99021，见实施例1。当体系中同时存在诱导物cpg、间充质干细胞和chir-99021时，对调节性b细胞的诱导效果最好。
9、具体地，体系中cpg的终浓度为2～10μg/ml，chir-99021的终浓度为4～12μm，间充质干细胞与b细胞的数量比为1：3～8。
10、更具体地，体系中cpg的终浓度为3～5μg/ml，chir-99021的终浓度为5～10μm，间充质干细胞与b细胞的数量比为1：4～6。
11、更具体地，体系中cpg的终浓度为4μg/ml，chir-99021的终浓度为10μm，间充质干细胞与b细胞的数量比为1：5。
12、可选地，所述基础培养基为rpmi-1640完全培养基。
13、具体地，所述调节性b细胞为表型为cd19+cd1c+的b细胞。
14、具体地，本专利技术诱导的调节性b细胞为人调节性b细胞。本专利技术经检测发现，利用本专利技术所述体系诱导获得的调节性b细胞主要富集于cd19+cd1c+b细胞，其表达il-10的能力与经典调节性b细胞cd24+cd27+b细胞相当，但cd19+cd1c+b细胞占cd19+b细胞的比例显著高于cd24+cd27+b细胞，即利用本专利技术所述体系可以诱导获得更多的调节性b细胞，大大提高了调节性b细胞的产生效率，诱导效率更高。本专利技术还请求保护所述体系在诱导调节性b细胞或在制备用于诱导调节性b细胞的制剂中的应用。
15、具体地，所述调节性b细胞为表型为cd19+cd1c+的b细胞。
16、本专利技术还提供了一种体外诱导和分选cd19+cd1c+b细胞的方法，所述方法为：将待诱导培养的cd19+b细胞置于所述体系中诱导培养36～48h，以cd1c为表面标志物分选得到cd19+cd1c+b细胞。
17、具体地，当体系中的诱导物含间充质干细胞时，需提前一天消化间充质干细胞，按70％的密度将间充质干细胞种于孔板中，过夜贴壁。
18、具体地，培养条件为35～38℃、5％co2。
19、具体地，通过流式细胞术分选得到cd19+cd1c+b细胞。
20、本专利技术具有以下有益效果：
21、本专利技术提供了一种用于诱导调节性b细胞的体系，其可以在促进b细胞表达il-10的同时减少炎症因子tnf-α的产生。在此基础上，本专利技术还提供了一种利用所述体系诱导获得调节性b细胞的方法。本专利技术利用高维多色流式检测诱导的调节性b细胞表型，发现诱导的调节性b细胞高表达cd1c，且与cd19+cd1c-b细胞相比，cd19+cd1c+b细胞表达更高水平的il-10。此外，本专利技术将cd19+cd1c-b细胞与外周血单个核细胞和效应t细胞分别共培养，发现其在体外能有效抑制外周血单个核细胞的增殖，减少效应t细胞分泌促炎因子tnf-α和ifn-γ。进一步构建人源化小鼠gvhd模型，发现输注cd19+cd1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于诱导调节性B细胞的体系，其特征在于，所述体系包括基础培养基和诱导物，所述诱导物包括CpG，还包括间充质干细胞和/或CHIR-99021；所述CpG的序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述体系，其特征在于，所述诱导物为CpG、间充质干细胞和CHIR-99021。
3.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，体系中CpG的终浓度为2～10μg/mL，CHIR-99021的终浓度为4～12μM，间充质干细胞与B细胞的数量比为1：3～8。
4.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640完全培养基。
5.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，所述调节性B细胞为表型为CD19+CD1c+的B细胞。
6.权利要求1或2所述体系在诱导调节性B细胞或在制备用于诱导调节性B细胞的制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述调节性B细胞为表型为CD19+CD1c+的B细胞。
8.一种体外诱导和分选CD19+CD1c+B细胞的方法，其特征在于
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，培养条件为35～38℃、5％CO2。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，通过流式细胞术分选得到CD19+CD1c+B细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种用于诱导调节性b细胞的体系，其特征在于，所述体系包括基础培养基和诱导物，所述诱导物包括cpg，还包括间充质干细胞和/或chir-99021；所述cpg的序列如seq idno.1所示。
2.根据权利要求1所述体系，其特征在于，所述诱导物为cpg、间充质干细胞和chir-99021。
3.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，体系中cpg的终浓度为2～10μg/ml，chir-99021的终浓度为4～12μm，间充质干细胞与b细胞的数量比为1：3～8。
4.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，所述基础培养基为rpmi-1640完全培养基。
5.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，所述调节性b细胞...
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