【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物材料，尤其涉及一种生理性混合凝胶前体溶液、凝胶材料及制备方法和应用。
技术介绍
1、血管是动物生命的基础，体外构建具有分支结构和灌注功能的血管网络可以广泛的用于科学研究和临床应用。文献报道胚胎干细胞(escs)和诱导的多能干细胞(ipscs)可以在体外自组织形成三维的具有在体外毛细血管网络结构和功能的血管类器官。已有的体外培养血管类器官的方法需要生物基质材料来作为三维结构的支撑，通常使用的是matrigel和胶原蛋白按照不同配比组成的三维混合凝胶材料，但matrigel是动物肿瘤来源的生物材料，因存在安全风险不适用于临床使用。此外，也有一些技术报道，可使用纤维蛋白和胶原蛋白按照不同配比制备的三维混合凝胶材料，但这种混合凝胶的三维支撑结构的稳定性不足，导致血管类器官的包裹性不足，影响血管类器官的出芽生长。
2、现有技术中，如专利申请cn111065731b公开了一种以ⅰ型和ⅳ型胶原蛋白为主的混合水凝胶材料，cn116836911a公开了一种以ⅰ型胶原蛋白和明胶为主的混合水凝胶材料，这两个技术方案均采用了高浓度的胶原蛋白材料，因此对于商业化制备血管类器官会带来较高的成本。cn117143359a公开了一种合成水凝胶，虽然能够达到血管类器官的生长的同时降低了制备成本，但是该材料不是生理性材料，具有不安全性、适用局限性和不稳定性。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种生理性混合凝胶前体溶液及
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
5、第一方面，本专利技术提供一种生理性混合凝胶前体溶液，由以下配料所组成：培养基、脾脏水凝胶、ⅰ型胶原蛋白0.8-1.2mg/ml、ⅳ型胶原蛋白0.1-0.5mg/ml、纤维蛋白原2.5-7.5mg/ml、抑肽酶1-5μg/ml；其中，脾脏水凝胶的浓度为2.5-12.5mg/ml；所述培养基是血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基；所述脾脏水凝胶是以动物脾脏细胞外基质为原料的水凝胶。其中，所述脾脏水凝胶原液的制备方法参见在先专利cn107224617b，也可采购已有的商品化产品。
6、根据本专利技术的较佳实施例，所述脾脏水凝胶原液的制备方法如下：
7、s1、制备生物基质材料：取同种或异种来源的动物脾脏组织进行处理制备成生物基质材料；处理方法是将取材的脾脏去除脾脏组织中的脂肪组织，剪成1-3mm3的组织小块浸泡在生理盐水中漂洗，然后经脱细胞处理，得到脱细胞的脾脏细胞外基质；
8、s2、消化：用去离子水清洗步骤s1获得的脾脏细胞外基质，震荡漂洗，每隔40-60min换一次水，共15-25次，去除残留的脱细胞试剂，真空冷冻干燥，称重，加入0.01-0.2m的盐酸溶液并研磨成匀浆，加入胃蛋白酶，恒温搅拌进行消化，得到均匀粘稠的脾脏细胞外基质溶液；
9、s3、孵育成胶：在冰浴条件下，用1m的氢氧化钠溶液调节脾脏细胞外基质溶液ph至中性，然后加入pbs溶液，置于37℃孵育成胶，于4℃保存。
10、根据本专利技术的较佳实施例，所述血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基为stemdifftm blood vessel organoid kit套装。该套装中有很多种基础培养基和添加因子，在实际血管类器官的培养过程中，可根据不同培养阶段选择不同的基础培养基和因子进行培养。在本专利技术的具体实施例中所涉及的培养阶段用的是stemdifftm blood vesselorganoid kit套装中的血管类器官成熟培养基。
11、根据本专利技术的较佳实施例，所述脾脏水凝胶是以猪脾脏和牛脾脏细胞外基质中至少一种为原料的水凝胶。
12、第二方面，本专利技术提供一种生理性混合凝胶前体溶液的制备方法，其包括如下步骤：
13、(1)使用血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基稀释脾脏水凝胶原液，得到第一分散液；将纤维蛋白原溶液、ⅰ型胶原蛋白溶液、ⅳ型胶原蛋白溶液和血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基进行混合，得到第二分散液；将抑肽酶溶液与血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基进行混合，得到第三分散液；
14、(2)将第一分散液、第二分散液、第三分散液混合，得到所述生理性混合凝胶前体溶液。
15、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，抑肽酶溶液为将抑肽酶冻干粉末溶解在无菌纯水得到；纤维蛋白原溶液为将牛纤维蛋白原和人纤维蛋白原中至少一种纤维蛋白原，溶解在30-38℃的生理盐水中并用0.22μm滤膜过滤得到；ⅰ型胶原蛋白溶液为将鼠尾胶原蛋白溶解在低浓度乙酸溶液得到；ⅳ型胶原蛋白溶液为人胶原蛋白溶解在低浓度乙酸溶液中再加无菌1×pbs溶液稀释得到。
16、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，纤维蛋白原溶液、ⅰ型胶原蛋白溶液和ⅳ型胶原蛋白溶液分别为采购已有的商品化产品，溶液中蛋白浓度约为4-10mg/ml。
17、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，先将血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基和脾脏水凝胶原液在4-8℃冰箱中分别冷藏12-24h后，将血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基与脾脏水凝胶原液混合，轻轻搅拌，混合均匀，离心去除气泡，得到第一分散液。
18、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，将血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基与ⅰ型胶原蛋白溶液、ⅳ型胶原蛋白溶液在冰上进行充分混合，再加入纤维蛋白原溶液后，缓慢摇晃，混合均匀，得到第二分散液。
19、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，将血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基和抑肽酶溶液分别在20-25℃环境中复温5-10min后，再充分混合，得到第三分散液。
20、根据本专利技术的较佳实施例，步骤(2)中，将第一分散液和第二分散液分别置于8-12℃下保持5-10min，再将二者充分混合均匀，再将第三分散液加入后，继续混合，得到所述生理性混合凝胶前体溶液。
21、第三方面，本专利技术还提供一种血管类器官的培养方法，包括：第一步：将凝血酶溶液加入到所述生理性混合凝胶前体溶液中，凝血酶加入量为10-30u/ml，混合均匀后，得到生理性混合凝胶预聚溶液；将血管类器官出芽生长的专用液体培养基与ⅰ型胶原蛋白混合组成凝胶混合培养液，其中ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.1-0.3mg/ml；
22、第二步：将血管类器官拟胚体球分散包裹在生理性混合凝胶预聚溶液中进行凝胶固化处理，固化处理温度为25-37℃，固化处理时间为1-2h，再将固化且包裹有血管类器官拟胚体球的凝胶材料浸泡在所述凝胶混合培养液中培养24h后，更换血管类器官出芽生长的专用液体培养基，静态培养5-15天，获得具有分支血管管腔样结构的血管类器官球；其中，血管类器官拟胚体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，由以下配料所组成：培养基、脾脏水凝胶、Ⅰ型胶原蛋白0.8-1.2mg/mL、Ⅳ型胶原蛋白0.1-0.5mg/mL、纤维蛋白原2.5-7.5mg/mL、抑肽酶1-5μg/mL；其中，脾脏水凝胶的浓度为2.5-12.5mg/mL；所述培养基是血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基；所述脾脏水凝胶是以动物脾脏细胞外基质为原料的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述脾脏水凝胶原液的制备方法如下：
3.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基为STEMdiffTM Blood VesselOrganoid Kit套装。
4.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述脾脏水凝胶是以猪脾脏和牛脾脏细胞外基质中至少一种为原料的水凝胶。
5.一种权利要求1-4任一项所述的生理性混合凝胶前体溶液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.一种血管类器官的培养方法，其特征在于，包括：<...
【技术特征摘要】
1.一种生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，由以下配料所组成：培养基、脾脏水凝胶、ⅰ型胶原蛋白0.8-1.2mg/ml、ⅳ型胶原蛋白0.1-0.5mg/ml、纤维蛋白原2.5-7.5mg/ml、抑肽酶1-5μg/ml；其中，脾脏水凝胶的浓度为2.5-12.5mg/ml；所述培养基是血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基；所述脾脏水凝胶是以动物脾脏细胞外基质为原料的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述脾脏水凝胶原液的制备方法如下：
3.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述血管类器官拟胚体出芽生长的专用液体培养基为stemdifftm blood vesselorganoid kit套装。
4.根据权利要求1所述的生理性混合凝胶前体溶液，其特征在于，所述脾脏水凝胶是以猪脾脏和牛脾脏细胞外基质中至少一种为原料的水凝胶。
5.一种权利要求1-4任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱楚洪，柯明，秦钟梁，蒋美琳，张笑晗，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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