【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组织培养，具体涉及一种通过发根农杆菌诱导的铁海棠毛状根诱导培养方法，该铁海棠毛状根中活性物质巨大戟醇的含量比原植物高。
技术介绍
1、铁海棠 [ euphorbia milii ch. des moulins] 是大戟科（euphorbiaceae）大戟属（ euphorbia）多年生蔓生灌木，别名有虎刺梅、麒麟刺等，原产非洲，广泛栽培于热带和温带地区。在我国南北方多作观赏植物栽培，常见于公园、植物园和庭院中。铁海棠也是一种药用植物，以茎叶、根及乳汁入药，性味苦涩凉，有小毒，入心经，具有解毒活血、排脓逐水等功效。研究表明铁海棠的化学成分主要为黄酮类、三萜类、二萜类及酚类等，其中富含大戟科植物特有的巨大戟醇酯类二萜化合物。该类化合物的母核巨大戟醇具有重要价值，是工业半合成生产可治疗光化性角化病药物巨大戟醇甲基丁烯酸酯的原料。然而，巨大戟醇仅在少数大戟属植物中分布，且从植株中分离得到巨大戟醇的产量很低，因此半合成获得巨大戟醇甲基丁烯酸酯的成本一直居高不下。2013年leo制药公司联合美国斯克里普斯研究所研究出巨大戟醇14步全合成方法，但因工艺难度大，得率极低（仅为1%左右），因而难以产业化生产。
2、毛状根是通过将发根农杆菌（ agrobacterium rhizogenes）ri质粒上的t-dna片段插入、整合到植物细胞基因组中并表达，诱导植物细胞长出的不定根。毛状根在形态上基本保持了植物原根的特
3、目前，关于铁海棠的毛状根诱导培养技术尚未见报道，本专利技术提供了一种高效诱导培养铁海棠毛状根的方法，获得的毛状根可提取获得比原植物中含量更高的巨大戟醇。本专利技术为高效获得包括巨大戟醇在内的活性大戟二萜类化合物提供了新的途径，也为铁海棠药用资源的进一步开发利用奠定了基础。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种高效诱导产巨大戟醇的铁海棠毛状根的方法，通过此方法获得的毛状根可提取获得大量巨大戟醇。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、一种可高效诱导培养铁海棠毛状根的方法包括以下步骤：
4、1）无菌外植体的制备：用铁海棠的花梗作为外植体，放入75%乙醇中消毒45 s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞消毒5 min，无菌水冲洗4～5次，切成1～1.5 cm长度，接入1/2ms固体培养基中，该培养基添加30 g/l蔗糖和2.5～3.0 g/l植物凝胶，ph值为5.8，接种后在25℃黑暗条件下预培养5～7天；
5、2）农杆菌的活化及菌液制备：取-80℃保存的发根农杆菌菌株ar a4 50 μl，加入5ml含50 mg/l 卡那霉素的yeb液体培养基中，28℃，180～200 r/min振荡培养24 h后，取1ml菌液接于含50 mg/l 卡那霉素的50 ml yeb液体培养基中，相同条件振荡培养至菌液od600 = 0.6～0.8，5000 r/min离心8～10 min，弃去上清，用50 ml含80～100 μmol/l 乙酰丁香酮的ms液体培养基重新悬浮菌体，得到活化的发根农杆菌菌液；
6、3）毛状根的诱导：将预培养后的外植体放入上述已制备好的侵染菌液中，侵染4～6 min，取出外植体，用无菌滤纸将表面的菌液吸干，置于同步骤1）的1/2ms固体培养基上，25℃黑暗共培养3天；
7、4）除菌诱导培养：所述共培养后的外植体置于除菌培养基上进行除菌诱导培养，除菌培养基为：1/2ms培养基+头孢噻肟钠，头孢噻肟钠初始添加浓度为400 mg/l，5～7天换一次培养基并逐步减少头孢噻肟钠的浓度，直到彻底去除发根农杆菌且不再添加头孢噻肟钠；
8、5）继代培养：取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上继代培养，所述继代培养基为：1/2ms固体培养基；
9、6）毛状根扩大培养：将步骤5）的毛状根转入到1/2ms液体培养基中，于25℃，100～120 rpm/min下进行扩大培养，每10天继代一次，可获得大量生长的铁海棠毛状根。
10、上述步骤2）中所述用于侵染的发根农杆菌菌株为ar a4，菌液振荡培养至od600 =0.6～0.8时进行离心，离心弃上清后重新悬浮菌体，加入的ms液体培养基中含有乙酰丁香酮浓度为80～100 μmol/l。
11、上述步骤4）除菌诱导培养过程具体包括：共培养后的外植体首先置于1/2ms固体基本培养基 + 400 mg/l头孢噻肟钠的除菌培养基上进行除菌培养，待肉眼可见长出毛状根且培养基和外植体表面均无肉眼可见菌斑后，可在继代时逐步降低头孢噻肟钠的浓度，每次降低50～100 mg/l，直到不添加头孢噻肟钠且得到彻底除菌后的毛状根。
12、本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种高效诱导培养铁海棠毛状根的方法，将铁海棠花梗作为外植体，经过发根农杆菌ar a4诱导获得生长迅速、状态稳定良好的铁海棠毛状根，将毛状根收集冻干后，可提取获得巨大戟醇及多种大戟二萜类化合物，为药用植物铁海棠活性次生代谢产物的生产及药用资源的进一步开发利用提供了技术支撑。
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1.一种高效诱导产巨大戟醇的铁海棠毛状根的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2）中所述用于侵染的发根农杆菌菌株为Ar A4。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2）中振荡培养发根农杆菌菌液至OD600 =0.6～0.8，且重新悬浮菌体时加入的乙酰丁香酮浓度为80～100 μmol/L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤4）除菌诱导培养过程具体包括：共培养后的外植体首先置于1/2MS固体基本培养基 + 400 mg/L头孢噻肟钠的除菌培养基上进行除菌培养，待肉眼可见长出毛状根且培养基和外植体表面均无肉眼可见菌斑后，可在继代时逐步降低头孢噻肟钠的浓度，每次降低50～100 mg/L，直到不添加头孢噻肟钠且得到彻底除菌后的毛状根。
【技术特征摘要】
1.一种高效诱导产巨大戟醇的铁海棠毛状根的方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2）中所述用于侵染的发根农杆菌菌株为ar a4。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤2）中振荡培养发根农杆菌菌液至od600 =0.6～0.8，且重新悬浮菌体时加入的乙酰丁香酮浓度为80～100 μmol/l。
【专利技术属性】
技术研发人员：李丕睿，陈雨，孙茜，李林蔚，王碧，刘飞，田梅，赵万里，徐曙，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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