【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学检测，具体涉及mirna-141的电化学检测方法。
技术介绍
1、为助力健康中国战略，不断创新与发展生物传感器的检测技术、分析效率和应用策略具有至关重要的科学意义和使用价值。mirna-141作为临床早期癌症诊断的潜在生物标志物，其异常表达与多种癌症密切相关，如肺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌等。然而，mirna-141具有序列短、丰度低以及同源序列相似度高等特点，这对mirna-141高灵敏和特异性地分析检测技术提出了更高的要求。
2、但是，现有技术中检测mirna-141的方法，灵敏度和特异性还不能满足检测需要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供mirna-141的电化学检测方法，具有较高的灵敏度和特异性。
2、本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
3、mirna-141的电化学检测方法，包括如下步骤：
4、(1)以不同浓度的mirna-141溶液进行检测，制作标准曲线；
5、(2)对待检样品进行检测，根据标准曲线计算待检样品中mirna-141浓度。
6、在本专利技术中，对待检样品或不同浓度的mirna-141溶液进行检测的方法包括如下步骤：
7、(1)羧基改性fe3o4纳米粒子与5’端氨基修饰的引物p1反应，得到p1-fe3o4复合物；通过碱基互补配对原则dna1、2和3结合在所述p1-fe3o4复合物上，得到杂交复合物；所述杂交复合物和双链特异性核酸酶与待检样品或不
8、(2)5’端羧基修饰的引物p2与表面氨基修饰的介孔二氧化硅纳米球结合，并与步骤(1)所述dsn作用后释放的ssdna反应，得到富含a和t碱基的dsdna-msns复合物；
9、(3)5’端修饰有巯基的捕获探针cp通过共价键组装到三维金纳米团簇修饰的铟锡电极上，得到cp/gnc/ito电极；将所述cp/gnc/ito浸泡在含有辅助探针hp和dsdna-msns复合物的溶液中，hp和dsdna-msns复合物组装到cp/gnc/ito表面，得到dsdna-msns/hp/cp/gnc/ito电极；然后在所述dsdna-msns/hp/cp/gnc/ito表面依次滴加抗坏血酸溶液和无水硫酸铜溶液，在35-40℃下40-60min，以促进铜纳米簇的形成；然后采用chi650e工作站对反应后的dsdna-msns/hp/cp/gnc/ito进行差分脉冲伏安法检测。
10、在本专利技术中，5’端氨基修饰的引物p1序列如下：5’-nh2-c6-ccatctttaccagacagtgtta-3’；dna1的序列如下：5’-acacatatatat-3’；dna2的序列如下：5’-ctggatatatat-3’；dna3的序列如下：5’-agatatatatat-3’；5’端羧基修饰的引物p2序列如下：5’-cooh-c6-atatatat-3’；hp的序列如下：5’-gtgtatatatat-3’；5’端修饰有巯基的捕获探针cp的序列如下：5’-sh-c6-atatatat-3’。
11、在本专利技术中，所述标准曲线的横坐标是lgc，c是mirna-141的浓度，纵坐标是不同浓度mirna-141与空白样检测的峰值电流差；所述空白样是不含mirna-141的超纯水溶液。
12、本专利技术检测方法的原理(图1)如下：以mirna-141为检测对象，通过双链特异性核酸酶(dsn)介导的靶标循环扩增策略(rca)，dna模板原位合成铜纳米簇(cu ncs)作电化学检测信号，建立了一种新型的无标记mirna电化学检测方法。首先，将三种富含a和t碱基的单链dna(ssdna，即dna1/2/3)与修饰在磁性介孔fe3o4纳米球上的引物p1(单链)通过部分碱基互补配对。当目标mirna-141存在时，p1特异性识别并高亲和力结合mirna-141形成双链，从而释放ssdna。在dsn作用的rca策略中，dsn高效识别并酶切完全互补配对的dna双链或者dna/rna杂交双链中的dna链，而对单链dna和单/双链rna无酶活性。因此，目标mirna从双链中释放出来，与未反应的p1杂交，进行酶切、释放和杂交的循环反应。利用磁性fe3o4进行磁分离后，释放的ssdna与介孔二氧化硅纳米球(msns)上负载的富含a和t碱基的单链dna(p2)杂交，得到富含a和t碱基的双链dna二氧化硅纳米球(dsdna-msns)复合物。随后，将其与辅助探针(hp)和捕获探针(cp)在电化学沉积了三维金纳米簇(gnc)的铟锡电极(ito)上层层组装，形成大量富含at碱基的双链dna并以此为模板，在还原剂和cu2+的作用下，以原位dna模板合成的cu ncs作电化学信号标记，通过三电极体系差分脉冲伏安法(dpv)实现高灵敏度和选择性检测mirna-141。
13、本专利技术提供的mirna-141的电化学检测方法，有益效果如下：
14、(1)高灵敏度。本专利技术方法，通过双链特异性核酸酶(dsn)介导的靶标循环扩增策略(rca)，dna模板原位合成铜纳米簇(cu ncs)作为电化学检测信号，不仅放大了电化学信号的读出，而且纳米材料大大加快了电子的传递，显著提高了检测的灵敏度和稳定性。本专利技术提供的电化学检测方法对mirna-141的线性检测范围为1fm-100nm，检测限为0.35fm。
15、(2)高特异性。多种不同序列对本专利技术方法检测mirna-141均无干扰。
16、(3)结果准确。本专利技术方法对mirna-141的回收率在95-105％之间。
17、(4)高通用性。本专利技术方法，操作简单、成本低，可以实现低浓度mirna-141的检测，具有良好的应用前景。
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1.miRNA-141的电化学检测方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于5’端氨基修饰的引物P1序列如下：5’-NH2-C6-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’；DNA1的序列如下：5’-ACACATATATAT-3’；DNA2的序列如下：5’-CTGGATATATAT-3’；DNA3的序列如下：5’-AGATATATATAT-3’；5’端羧基修饰的引物P2序列如下：5’-COOH-C6-ATATATAT-3’；HP的序列如下：5’-GTGTATATATAT-3’；5’端修饰有巯基的捕获探针CP的序列如下：5’-SH-C6-ATATATAT-3’。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述标准曲线的横坐标是lgC，C是miRNA-141的浓度，纵坐标是不同浓度miRNA-141与空白样检测的峰值电流差；所述空白样是不含miRNA-141的超纯水溶液。
【技术特征摘要】
1.mirna-141的电化学检测方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于5’端氨基修饰的引物p1序列如下：5’-nh2-c6-ccatctttaccagacagtgtta-3’；dna1的序列如下：5’-acacatatatat-3’；dna2的序列如下：5’-ctggatatatat-3’；dna3的序列如下：5’-agatatatatat-3’；...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小燕，陈晓君，彭钢，
申请(专利权)人：浙江国际海运职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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