【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程。
技术介绍
1、基于ivt(in vitro transcription，体外转录)的合成平台、核苷酸化学、传递系统等相关技术的快速发展，使得针对不同疾病的mrna药物迅速开发。传统上，mrna是通过ivt反应合成的，使用t3、t7或sp6 rna聚合酶催化线性化质粒dna在5’→3’方向上形成rna。dna模板包含启动子、5’非翻译区(5’utr)、开放阅读框架(orf)、3’非翻译区(3’utr)和一个poly a尾。
2、质粒dna可以以三种构象存在：1)超螺旋(sc)，通常也称为共价闭合环状dna(ccc)；2)开环(oc)dna；和3)线性dna。此外，质粒通常以多聚体的形式出现，这是由于在宿主细菌中发生同源重组或连续复制造成的。
3、工业上，需要持续提供序列稳定的质粒dna，以进行ivt mrna生产。因此，应当避免菌株、质粒发生改变。此外，当菌株出现污染时，也需要确保有备份菌株以确保后续质粒生产。基于以上需求，需要建立菌株细胞库(cell bank)以为质粒dna的生产提供检定合格、质量相同、能持续稳定传代的细胞。
4、工业生产中，细胞库主要分为实验细胞库(research cell bank,rcb)、原始细胞库(pre-master cell bank,pcb)、主代细胞库(master cell bank,mcb)和工作细胞库(work cell bank,wcb)。其中，rcb的构建方法主要包括：将测序正确的质粒转化至宿主细胞(如大肠杆菌细胞)，经
5、用筛选得到的rcb做种子，进行pcb建库：取一支rcb室温化冻，混匀后按照一定的比例接种至培养基，经适宜条件培养至菌液变浑浊，再加入等体积的甘油溶液混匀、分装，先暂存于超低温冰箱中过夜，再转入液氮中长期保存。之后进行mcb与wcb的制备：取一支pcb/mcb甘油菌室温化冻，混匀后按照一定的比例接种至培养基，经适宜条件培养至菌液变浑浊，再加入等体积的甘油溶液混匀、分装。mcb在超低温冰箱中保存12～48h后再转移至液氮罐中长期保存；wcb则直接在超低温冰箱中长期保存。
6、专利技术人发现，在构建rcb、pcb、mcb和wcb，以及使用wcb发酵生产质粒过程中，由于质粒在宿主细菌中进行多次复制，从而降低了模板质粒poly a尾的完整性。具体表现在使用wcb生产的质粒体外转录时会产生含有不同长度poly a尾的mrna，从而降低mrna原料药的均一性或纯度。因此，亟需建立一种在细胞传代过程中保持mrna转录用质粒序列稳定性的方法。
7、为了解决以上问题，专利技术人发现，将外源mrna生产质粒转入大肠杆菌感受态细胞后，根据大肠杆菌中质粒的拓扑结构，可以将转化后的大肠杆菌分为以下三个类别：1)第i类克隆，其中质粒超螺旋单体大于10％；2)第ii类克隆，其中质粒超螺旋单体小于10％、质粒超螺旋二聚体为10-100％；和第iii类克隆，其中质粒超螺旋单体小于10％、质粒超螺旋二聚体小于10％。专利技术人发现，第ii类克隆在多次传代后，质粒拓扑结构基本保持不变，质粒产量更高，质粒中poly a完整性优于第i类和第iii类克隆。以多次传代后的细胞生产质粒，并经线性化后转录得到的mrna，其纯度与细胞表达也优于其余两类克隆。以上结果表明，通过本专利技术方法得到的第ii类克隆在多次传代后质粒产量更高，在多次传代过程中能保持质粒poly a尾的结构完整性，以此线性化质粒为模板转录得到的mrna纯度与细胞表达效果更好。本专利技术为ivt反应中质粒的选择提供了一种新的思路，可以用于构建用于mrna商业化生产的相关细胞库(如rcb、pcb、mcb和wcb)。
技术实现思路
1、在本专利技术的一个方面中，本专利技术提供一种分离的含有外源质粒的大肠杆菌细胞群，所述外源质粒可以在体外转录为mrna，所述外源质粒包含质粒骨架、调控外源编码基因的启动子(如t7启动子、sp6启动子、t3启动子或t5启动子)、5’非翻译区(5’utr)、外源编码基因、3’非翻译区(3’utr)和polya尾巴，其中所述外源质粒在大肠杆菌细胞群中的拓扑结构占比为：质粒超螺旋单体小于10％(优选小于5％，更优选小于2％，最优选小于1％)、质粒超螺旋二聚体为10-100％(优选30-100％，更优选40-100％，更优选50-100％，更优选60-80％，更优选70-80％，更优选70-90％)。
2、在一个实施方案中，所述质粒骨架为pvax1(如seq id no：1所示)或pdna2.0(atum公司)。
3、本专利技术中，术语“质粒骨架”为不包含不包含调控外源编码基因的启动子、5’utr、外源编码基因、3’utr和polya尾巴的质粒载体。可以将前述不包含调控外源编码基因的启动子、5’utr、外源编码基因、3’utr和polya尾巴及线性化酶切位点以本领域常规手段插入到质粒骨架中，以制备本专利技术的mrna体外转录用质粒。
4、本专利技术中，调控外源编码基因的启动子可以是t7启动子。
5、在一个实施方案中，所述外源编码基因编码感兴趣的肽或蛋白质，优选选自下组：细胞因子(例如白介素(优选il-12或il-2或il-7))；例如促红细胞生成素；黏附分子，例如整联蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如，一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒抗原，例如一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)人乳头瘤病毒(hpv)抗原、猴痘病毒抗原、流感病毒(a、b或c)抗原、cmv抗原或rsv抗原)、变应原或自身抗原；激素，例如加压素、胰岛素或生长激素；生长因子，例如vegfa；酶，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶或乳糖酶；受体，例如生长因子受体；蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡调节剂，例如bax；转录因子，例如foxp3；肿瘤抑制蛋白，例如p53；结构蛋白，例如表面活性型蛋白质；重编程因子，例如oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28或nanog；基因组改造蛋白，例如成簇规本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的含有外源质粒的大肠杆菌细胞群，所述外源质粒可以在体外转录为mRNA，所述外源质粒包含质粒骨架、启动子(优选为T7启动子、SP6启动子、T3启动子或T5启动子)、5’非翻译区(5’UTR)、外源编码基因、3’非翻译区(3’UTR)和polyA尾巴，其中所述大肠杆菌细胞群中所述外源质粒的拓扑结构占比为：质粒超螺旋单体在质粒超螺旋单体、质粒超螺旋二聚体、质粒超螺旋三聚体和质粒超螺旋四聚体之和中的比例小于10％(优选小于5％，更优选小于2％，最优选小于1％)、质粒超螺旋二聚体在质粒超螺旋单体、质粒超螺旋二聚体、质粒超螺旋三聚体和质粒超螺旋四聚体之和中的比例为10-100％(优选30-100％，更优选40-100％，更优选50-100％，更优选60-80％，更优选70-80％，更优选70-90％)，
2.一种研究细胞库(RCB)的制备方法，其包括：将权利要求1所述的大肠杆菌细胞群与冷冻保护剂(优选为30-70％甘油(v/v)，更优选40％-50％(v/v)甘油)混合后分装(优选1mL/支)，从而制备得到所述RCB；优选地，
3.一种原始细胞库(PCB)
4.一种主代细胞库(MCB)的制备方法，其包括：将权利要求3所述的PCB化冻，混匀后，接种到抗生素抗性培养基(优选为LB抗生素抗性培养基，更优选为LB Kan)中，放置在恒温培养振荡器中约37℃，约220rpm培养约12h，加入冷冻保护剂(优选为30-70％甘油(v/v)，更优选40-50％甘油(v/v))后混匀，和分装后保存，从而得到主代细胞库(MCB)；优选地，
5.一种工作细胞库(WCB)的制备方法，其包括：将权利要求4所述的MCB化冻，混匀后，接种到抗生素抗性培养基(优选为LB抗生素抗性培养基，更优选为LB Kan)中，放置在恒温培养振荡器中约37℃，约220rpm培养约12h，加入冷冻保护剂(优选为30-70％甘油(v/v)，更优选40-50％甘油(v/v))后混匀，和分装后保存，从而得到工作细胞库(WCB)；优选地，
6.由权利要求2所述方法制备得到的研究细胞库(RCB)、由权利要求3所述方法制备得到的原始细胞库(PCB)、由权利要求4所述方法制备得到的主代细胞库(MCB)，或者由权利要求5所述方法制备得到的工作细胞库(WCB)。
7.一种质粒的生产方法，所述质粒能够在体外转录出含polyA尾巴的mRNA，所述方法包括：
8.一种体外转录生产含polyA尾巴的mRNA的方法，所述方法包括：
9.一种提高体外转录生产的mRNA纯度的方法，所述mRNA包含polyA尾巴，所述方法包括：
10.一种提高质粒产量的方法，所述质粒能够在体外转录出含polyA尾巴的mRNA，所述方法包括：
11.权利要求10或权利要求11的方法，其中
...【技术特征摘要】
1.一种分离的含有外源质粒的大肠杆菌细胞群，所述外源质粒可以在体外转录为mrna，所述外源质粒包含质粒骨架、启动子(优选为t7启动子、sp6启动子、t3启动子或t5启动子)、5’非翻译区(5’utr)、外源编码基因、3’非翻译区(3’utr)和polya尾巴，其中所述大肠杆菌细胞群中所述外源质粒的拓扑结构占比为：质粒超螺旋单体在质粒超螺旋单体、质粒超螺旋二聚体、质粒超螺旋三聚体和质粒超螺旋四聚体之和中的比例小于10％(优选小于5％，更优选小于2％，最优选小于1％)、质粒超螺旋二聚体在质粒超螺旋单体、质粒超螺旋二聚体、质粒超螺旋三聚体和质粒超螺旋四聚体之和中的比例为10-100％(优选30-100％，更优选40-100％，更优选50-100％，更优选60-80％，更优选70-80％，更优选70-90％)，
2.一种研究细胞库(rcb)的制备方法，其包括：将权利要求1所述的大肠杆菌细胞群与冷冻保护剂(优选为30-70％甘油(v/v)，更优选40％-50％(v/v)甘油)混合后分装(优选1ml/支)，从而制备得到所述rcb；优选地，
3.一种原始细胞库(pcb)的制备方法，其包括：将权利要求2所述的rcb化冻，接种到抗生素抗性培养基(优选为lb抗生素抗性培养基，更优选为lb kan)中，在摇床中约37℃，约220rpm培养约12h，加入冷冻保护剂(优选为30-70％甘油(v/v)，更优选40-50％甘油(v/v))后混匀，和分装后保存，从而得到原始细胞库(pcb)；优选地，
4.一种主代细胞库(mcb)的制备方法，其包括：将权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王德华，特奥得琳达·米拉贝拉，韦浩楠，亓娟，李翠翠，
申请(专利权)人：南京吉迈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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