【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因芯片，尤其涉及牛四种呼吸道系统疾病的基因芯片检测方法，该检测方法可以检测bpiv3、brsv、ibrv和bvdv。
技术介绍
1、呼吸道疾病一直是威胁牛健康的重要疾病之一。尤其是近年来集约化养殖模式的发展和地域规模化养殖的不平衡，加之饲养环境的变化、管理水平的不足和长途运输的应急等，导致呼吸道疾病的发病率和死亡率不断提高，给牛、羊养殖业造成了重大的经济损失。
2、牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex，brdc)是世界范围内引起牛呼吸道疾病和死亡的主要原因。感染brdc的牛会出现发烧、呼吸急促、反复咳嗽、流鼻涕或眼泪、腹泻、脱水和食欲不振等症状，这些症状会对牛的健康和生产性能造成很大影响，进而影响经济效益。
3、传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitis virus，ibrv)，牛副流感3型病毒(bvine parainfluenzavirus type3，bpiv3)，牛呼吸道合胞病毒(bovinerespiratory syncytial virus，brsv)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus，bvdv)是引起牛呼吸道疾病综合征(brdc)的四种主要病毒性病原。
4、由于传统的病原学检测方法例如病毒分离培养、免疫荧光检测和酶联免疫吸附试验等虽然有其成功的应用，但在应对多种动物疫病鉴别诊断问题上，往往一筹莫展。近年来，基因芯片技术被广泛应用于医学
5、本申请基因芯片检测技术，致力于建立一种高效、快速、准确的牛呼吸道疫病基因芯片鉴别诊断检测方法，为快速检测牛呼吸道疾病及其流行病学调查提供有用的工具。建立brdc中四种重要牛呼吸道疾病ibrv、bpiv3、brsv和bvdv鉴别检测方法，开发一种以高瓴材料生物芯片为载体的ibrv、bpiv3、brsv和bvdv鉴别诊断基因芯片检测试剂盒，在临床上可快速区分ibrv、bpiv3、brsv和bvdv单一感染或者混合感染，搭建brdc鉴别检测基因芯片法检测技术平台，实现在农户或养殖场进行大规模现场检测。
技术实现思路
1、本专利技术提供以下技术方案：
2、1：联检芯片制备：利用德国scienion公司的sciflexarrayer点样仪，通过非接触式方式结合压电陶瓷技术进行超微量分液点样，制备含固定排列模式的基因(探针，包括阳性质控用探针)芯片。开发基于高瓴生物反应材料作为高性能生物芯片纳米膜技术，研发基于“0+x”中低密度牛高发性动物疫病鉴别诊断基因芯片法，具有零背景能力、共价固定能力、超宽的负载区间和三维呈现能力等优点，特异性强、灵敏度高。
3、高瓴tm生物反应基底材料是新一代高性能生物芯片基底材料，在基因、蛋白质和多肽(小分子)等芯片的构建中，可替代尼龙膜、玻片等传统的基底材料。它具有独特的微纳结构和表面化学性质，可高密度的共价固定核酸、多肽等小分子和蛋白质，并实现三维空间展示；可在无需bsa封闭的情况下，同时实现降低检测背景噪音和提升灵敏度；简化清洗等步骤，节省操作时间。
4、主要优点如下：①零背景能力：在溶液中蛋白质的总浓度不高于500μg/ml条件下，无需bsa等封闭操作即可防止蛋白作的非特异性吸附。②共价固定能力：cooh在edc/nhs活化的条件下，可以固定有氨基的探针，包括但不限于核酸，短肽，蛋白，细胞，病毒等等。③超宽的负载区间：以某短肽固定为例，一系列点样浓度下，该短肽对应的单抗有可以区分的信号值。④三维呈现能力：有利于prey-bait的互作，减少空间位阻，实现快速检测。
5、2、流行病学调查：开展新疆地区集约化牛养殖场ibrv、bpiv3、brsv和bvdv等呼吸道疫病的流行病学调查，包括病原学抗原检测和血清学抗体检测，了解新疆部分地区上述四种牛呼吸道疫病的流行态势。对病原学检测阳性的上述四种牛呼吸道流行毒株进行分离和鉴定，利用mafft、mega7、fasttree等分析软件，进行多序列比对，进化距离，系统发育，保守性等生物信息学分析后，确定目标靶点序列。
6、分别建立ibrv、bpiv3、brsv和bvdv普通pcr检测方法，优化反应体系应用于实际临床样本检测中。对获得的阳性样本进行全基因组测序分析，并用适合毒株生长的体外细胞或培养基进行培养分离。分离及鉴定ibrv、bpiv3、brsv和bvdv各10份。
7、3、联检芯片检测方法的构建：根据上述疫病流行毒株鉴定结果，将目标菌、毒株的全基因组序列与ncbi的动物nt库以及细菌nt库(去除了目标菌种序列)进行比较，对没有比对到数据库的序列进行筛选，进一步采用orthomcl对目的基因进行聚类分析。最终得到ibrv、bpiv3、brsv和bvdv特异性基因。利用oligo6.0引物-探针设计软件和dnastar等生物分析软件，针对上述四种病毒设计引物和探针。利用德国scienion公司的sciflexarrayer点样仪，通过非接触式方式结合压电陶瓷技术进行超微量分液点样，制备含固定排列模式的基因(探针，包括阳性质控用探针)芯片。针对每种病毒，先用10份阳性样本和10份阴性样本进行rt-pcr/探针杂交测试，优化rt-pcr、杂交、探针、引物等条件，确定探针/引物组合，完成芯片制备，核酸提取，rt-pcr，杂交等生产工艺，检测流程以及结果判定。
8、3.1特异性试验：采用建立的牛呼吸道疾病综合征主要病毒性病原bpiv3、brsv、ibrv和bvdv基因芯片检测试剂盒和临床检测阳性并已用国标或者其它检测方法验证的验样本进行检测，符合率为99％以上，并且能鉴别区分上述单病感染或多病种感染。证实该方法与其他相关病毒无交叉反应，具有良好的特异性，且能在检测诊断单病种的同时区分是否发生多重原体感染。
9、3.2敏感性试验：将构建的牛呼吸道疾病综合征主要病毒性病原bpiv3、brsv、ibrv和bvdv的质粒进行10倍梯度稀释后，分别用牛呼吸道疾病综合征主要病毒性病原bpiv3、brsv、ibrv和bvdv基因芯片检测试剂盒，根据芯片反应结果计算芯片灵敏度。利用道尔顿拷贝数计算公式【拷贝数＝质粒浓度6.02×1023/(660×质粒长度)】得出单病种检测和多病种检测灵敏度极限值本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.牛呼吸道疾病BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV的基因芯片检测试剂盒，其特征在于：将如下引物：
2.牛呼吸道疾病BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV的基因芯片检测方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.牛呼吸道疾病bpiv3、brsv、ibrv和bvdv的基因芯片检测试剂盒，其特征在于：将如下引物：...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄新，徐雪可，钟发钢，张倩，张乾义，张星星，韩猛立，赵文娟，吴桐忠，王莉莉，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：
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