【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及实验动物模型构建方法以及抗环境因素相关的癫痫药物筛选，具体涉及了一种癫痫动物模型的构建方法以及由该模型筛选获得的用于治疗癫痫的药物。
技术介绍
1、癫痫是一种慢性神经系统疾病，特征为大脑局部或广泛区域的异常弥漫性放电。它通常表现为反复且无法控制的发作，对患者有严重的认知、社会和心理影响。癫痫是全球最普遍和最严重的脑部疾病之一，估计影响约6500万人。癫痫的发病率和患病率在儿童和老年人中较高，特别是1岁以下的婴儿和50岁以上的老人。癫痫很少单独发生：超过50％的癫痫患者伴有抑郁症、焦虑症和自闭症等共病。在临床环境中，癫痫患者的焦虑患病率大约为儿童的30％-35％和成人的11％-50％。病理生理学上，癫痫是神经回路中兴奋性和抑制性神经活动失衡的结果，通常源于过度兴奋或抑制减弱。癫痫可以由各种脑部病理引起，包括发育畸形、脑外伤、肿瘤以及细菌和寄生虫感染等。大约60％的癫痫病例的病因尚不清楚，为了更好地研发治疗癫痫的药物，需要对癫痫的发病机制进行进一步研究。
2、癫痫动物模型是研究癫痫发病机制、药物筛选及治疗策略的重要工具。这些模型旨在模拟人类癫痫的特定方面，尽管它们不能完全复制人类疾病的全部复杂性。例如，使用戊四唑增强兴奋性神经传递，导致神经元过度兴奋和放电，制备获得的癫痫动物模型适用于初步筛选抗癫痫药物。通过电刺激模拟人类的强直阵挛癫痫大发作，进而制备癫痫的电休克模型。通过高温环境诱发幼龄动物的热惊厥，模拟人类儿童高热惊厥，进而制备癫痫的高热惊厥模型。癫痫是一种复杂的神经系统疾病，其发病机制涉及遗传因素、脑
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于一种癫痫动物模型的构建方法，以解决现有技术中缺少与环境因素相关的癫痫动物模型的技术问题。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种癫痫动物模型的构建方法，所述癫痫动物模型为氯菊酯暴露导致的癫痫的斑马鱼模型；将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有100-500μg/l的氯菊酯的环境中，直至3dpf-5dpf；或者将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有50μg/l的氯菊酯的环境中，直至3dpf-6个月。
4、进一步，所述药物用于治疗氯菊酯暴露导致的癫痫；用于构建癫痫动物模型的斑马鱼为野生型斑马鱼或者转基因斑马鱼；所述癫痫动物模型表现出抽搐、眼震、神经元损伤和神经元增殖减少的性状。
5、进一步，将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有500μg/l的氯菊酯的环境中，然后在3hpf-2dpf加入待筛选药物，继续培养直至3dpf-5dpf。
6、或者，在斑马鱼胚胎的单细胞阶段注射用于敲除scn8aa基因的试剂，获得scn8aa基因敲除斑马鱼；将3hpf的scn8aa基因敲除斑马鱼的胚胎浸泡在含有500μg/l的氯菊酯的环境中，继续培养直至3dpf-5dpf。
7、进一步，所述的药物包括托吡酯、丙戊酸钠和卡马西平中的至少一种；优选地，包括丙戊酸钠或者卡马西平；进一步优选地，包括卡马西平。
8、进一步，托吡酯、丙戊酸钠和卡马西平的工作浓度分别为：50μg/ml、150μg/ml、50mg/l。
9、进一步，所述的药物包括美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和sym2206中的至少一种；
10、或者包括用于敲除scn8aa基因的试剂；所述试剂包括grna1和cas9蛋白形成的核糖核蛋白复合体，以及grna2和cas9蛋白形成的核糖核蛋白复合体；grna1由tracrrna和序列为seq id no.1的crrna组成，grna2由tracrrna和序列为seq id no.2的crrna组成；所述试剂用于在野生型斑马鱼胚胎的单细胞阶段进行注射。
11、进一步，所述的药物为美索巴莫和氟卡尼醋酸盐形成的组合物，或者为美索巴莫和sym2206形成的组合物，或者为氟卡尼醋酸盐和sym2206形成的组合物，或者为美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和sym2206形成的组合物；
12、优选地，其为美索巴莫和sym2206形成的组合物，或者为氟卡尼醋酸盐和sym2206形成的组合物，或者为美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和sym2206形成的组合物。
13、进一步，美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和sym2206的用量比为25：10：1。
14、进一步，所述的药物，其包括d-ap5、cnqx和巴氯芬中的至少一种；
15、优选地，其为d-ap5、或者cnqx、或者巴氯芬、或者d-ap5和cnqx形成的组合物。
16、进一步，d-ap5、cnqx和巴氯芬单独使用时的工作浓度分别为20μg/ml、4μg/ml和50μg/ml；d-ap5和cnqx组合使用时用量比为20：4。
17、本技术方案的技术原理和有益效果在于：
18、在本研究中，我们观察到暴露于环境浓度氯菊酯的斑马鱼，表现出类似于癫痫全身性发作的表型或易感性，并且根据行为、电生理和神经病理学评估的结果，暴露于氯菊酯的斑马鱼几乎完全展示了癫痫的基本特征。因此，氯菊酯可作为一种诱导癫痫的工具，暴露于氯菊酯的斑马鱼在癫痫研究中可用作模式生物，即由环境暴露导致的癫痫的动物模型。在暴露于超过50μg/l氯菊酯的样本中，观察到了类似眼震的现象。这一症状类似于某些癫痫患者中观察到的眼震。然而，这种眼动现象在用其他化学物质(包括戊四唑ptz，一种常用的用于癫痫动物模型建模的药物)处理的斑马鱼中并未发现。我们认为，这种眼震表型可以作为研究癫痫的理想指标，并有助于大规模筛选特定的抗癫痫药物。
19、在氯菊酯暴露后添加抗癫痫药物托吡酯(tpr)、丙戊酸钠(vpa)和卡马西平(cbz)可以缓解胚胎的抽搐，而添加抗癫痫药物乙琥胺(esx)的效果有限。说明针对氯菊酯暴露导致的癫痫，和其他诱因导致的癫痫的机制和所需的治疗手段存在特殊性和不同。专利技术人分析原因可能在于：tpr、vpa和cbz降低谷氨酸水平并增加gaba水平，而esx则增加谷氨酸水平并减少gaba水平。由于四种药物的作用机制的差异，导致其对于氯菊酯暴露导致的癫痫的治疗效果存在差异。其中cbz的效果尤为优异，其次依次为vpa、trp，esx甚至在某些指标上相对于氯菊酯单独处理组效果更差。
20、除此之外，针对nav1.4和nav1.5的特异性抑制剂减少了氯菊酯处理的斑马鱼的尾部抽搐和眼球运动频率，这表明氯菊酯暴露可能影响肌肉收缩的强度，类似于伴有肌肉抽搐的强直性和阵挛性发作。然而，抑制nav1.6而不是nav1.4或nav1.5时，神经元的数量部分增加。这些结果表明，钠离子通道在神经元中具有多种功能。nav1.6可能是氯菊酯在癫痫中主要作用的靶点，敲除nav1.6的亚基基因可以缓解氯菊酯导致的癫痫症状。使用美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和sym2206，分别本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种癫痫动物模型的构建方法，其特征在于：所述癫痫动物模型为氯菊酯暴露导致的癫痫的斑马鱼模型；将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有100-500μg/L的氯菊酯的环境中，直至3dpf-5dpf；或者将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有50μg/L的氯菊酯的环境中，直至3dpf-6个月。
2.使用权利要求1所述的构建方法形成的癫痫动物模型筛选获得的药物，其特征在于：所述药物用于治疗氯菊酯暴露导致的癫痫；用于构建癫痫动物模型的斑马鱼为野生型斑马鱼或者转基因斑马鱼；所述癫痫动物模型表现出抽搐、眼震、神经元损伤和神经元增殖减少的性状。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述癫痫动物模型按照如下方法制备获得：将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有500μg/L的氯菊酯的环境中，然后在3hpf-2dpf加入待筛选药物，继续培养直至3dpf-5dpf。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：包括托吡酯、丙戊酸钠和卡马西平中的至少一种；优选地，包括丙戊酸钠或者卡马西平；进一步优选地，包括卡马西平。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：托吡酯、
6.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：包括美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和SYM2206中的至少一种；
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：其为美索巴莫和氟卡尼醋酸盐形成的组合物，或者为美索巴莫和SYM2206形成的组合物，或者为氟卡尼醋酸盐和SYM2206形成的组合物，或者为美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和SYM2206形成的组合物；
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：美索巴莫、氟卡尼醋酸盐和SYM2206的用量比为25：10：1。
9.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：其包括D-AP5、CNQX和巴氯芬中的至少一种；
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：D-AP5、CNQX和巴氯芬单独使用时的工作浓度分别为20μg/mL、4μg/mL和50μg/mL；D-AP5和CNQX组合使用时用量比为20：4。
...【技术特征摘要】
1.一种癫痫动物模型的构建方法，其特征在于：所述癫痫动物模型为氯菊酯暴露导致的癫痫的斑马鱼模型；将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有100-500μg/l的氯菊酯的环境中，直至3dpf-5dpf；或者将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有50μg/l的氯菊酯的环境中，直至3dpf-6个月。
2.使用权利要求1所述的构建方法形成的癫痫动物模型筛选获得的药物，其特征在于：所述药物用于治疗氯菊酯暴露导致的癫痫；用于构建癫痫动物模型的斑马鱼为野生型斑马鱼或者转基因斑马鱼；所述癫痫动物模型表现出抽搐、眼震、神经元损伤和神经元增殖减少的性状。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述癫痫动物模型按照如下方法制备获得：将3hpf的斑马鱼胚胎浸泡在含有500μg/l的氯菊酯的环境中，然后在3hpf-2dpf加入待筛选药物，继续培养直至3dpf-5dpf。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：包括托吡酯、丙戊酸钠和卡马西平中的至少一种；优选地，包括丙戊酸钠或者卡马西平；进一步优选地，包括卡马西平。
【专利技术属性】
技术研发人员：李礼，苏明，冯智，徐海燕，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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