一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法技术

技术编号：44387405 阅读：2 留言：0更新日期：2025-02-25 10:03

本发明专利技术公开了一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，涉及内源性人源HDAC11蛋白包涵体技术领域；为了提高蛋白包涵体的纯度；具体包括以下步骤：S1：PEGX‑6p‑1‑GST‑homo‑HDAC11(去信号肽)载体构建；S2：PEGX‑6p‑1‑GST‑homo‑HDAC11(去信号肽)Rosetta菌诱导；S3：包涵体GST‑HDAC11(去信号肽)蛋白纯化。本发明专利技术通过纯化包涵体可以显著提高目标蛋白的产量，包涵体的纯化过程通常包括离心、洗涤和溶解等步骤，这些步骤有助于去除大部分细胞碎片和其他杂质，提高蛋白质的纯度，同时纯化的包涵体通过变性和复性的方法重新折叠成具有生物活性的蛋白质。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及内源性人源hdac11蛋白包涵体，尤其涉及一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法。

技术介绍

1、在现有技术中，内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化，通过纯化包涵体，可以显著提高目标蛋白的产量。这对于需要大量蛋白质进行结构研究或功能分析的实验尤为重要，hdac11与多种疾病相关，纯化的hdac11蛋白可以用于建立体外疾病模型；

2、但是目前内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化存在蛋白表达量低、包涵体难以溶解、复性效率低的不足，因此需要对其纯化方法进行优化和改进，从而促进其纯化效果；

3、基于此本申请提出一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法。

2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：

3、一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法，s1至s5，其中s1步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)重组质粒构建；s2步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)rosetta菌诱导；s3步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)包涵体蛋白纯化；s4步骤为gst-beads富集gst-homo-hdac11(去信号肽)蛋白；s5步骤为sds-page和western blot验证蛋白的表达和纯度。</p>

4、优选的：s1步骤中载体构建包括设计引物、pcr扩增、酶切、连接、转化、鉴定六个子步骤。

5、优选的：s1中的引物步骤包括使用一对特异性引物扩增hdac11基因片段；pcr扩增步骤包括使用设计的引物和293t cell cdna模板进行pcr扩增得到hdac11(去信号肽)基因片段；酶切步骤包括使用ecori和noti对pcr扩增得到的hdac11基因片段和pegx-6p-1质粒进行酶切处理。

6、优选的：s1中的连接步骤包括将酶切后的homo-hdac11(去信号肽)基因片段和pegx-6p-1质粒进行连接反应形成重组质粒；转化步骤包括将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中并挑选出含有重组质粒的阳性克隆；鉴定步骤包括对阳性克隆进行菌落pcr鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。

7、优选的：s2步骤中的rosetta菌诱导包括将测序正确的重组质粒转化到rosetta感受态细胞中，挑选出含有重组质粒的阳性克隆，接种到含有氨苄西林的lb液体培养基中，震荡培养至菌液od 600＝0.6-0.8，向培养基中加入iptg至终浓度为0.1mm，继续培养5h，离心收集菌体，弃去上清液，高压破碎菌体，收集gst-homo-hdac11(去信号肽)包涵体蛋白。

8、优选的：s3步骤中的包涵体蛋白纯化包括裂解液重悬菌体，高压破碎菌体，收集包涵体沉淀，包涵体洗涤，包涵体溶解(变性)，梯度复性，收集复性后gst-homo-hdac11(去信号肽)蛋白上清，包涵体洗涤包括粗洗涤和精洗涤两个步骤。

9、优选的：s3中的包涵体洗涤液组成为20mm tris，1mm edta，2murea，1m nacl，1％tritonx-100，用hcl调整ph＝8。

10、在前述方案的基础上：s3中的复性溶液组成为tris 2.42g，nacl：8.76g(1l)，复性液i为4m urea，复性液ii为2m urea，复性液iii为1m urea，复性液iv为0m urea。

11、在前述方案的基础上：s4步骤中的gst-beads富集gst-homo-hdac11(去信号肽)蛋白包括灭菌ddh2o清洗gst-beads 3次，洗去酒精；加入与bead等体积的1×pbs平衡gst-beads 3次；平衡好的gst-beads与gst-homo-hdac11(去信号肽)包涵体复性后蛋白上清室温旋转孵育2h；加入2倍beads体积的1×pbs清洗gst-beads-蛋白复合物，7次；20μl 1xsdsloading buffer煮脱beads，98℃，10min。

12、在前述方案的基础上：s5步骤中的sds-page和western blot验证蛋白的表达和纯度。

13、本专利技术的有益效果为：

14、1.通过纯化包涵体可以显著提高目标蛋白的产量，包涵体的纯化过程通常包括离心、洗涤和溶解等步骤，这些步骤有助于去除大部分细胞碎片和其他杂质，提高蛋白质的纯度，同时纯化的包涵体通过变性和复性的方法重新折叠成具有生物活性的蛋白质。

15、2.纯化的hdac11蛋白可以用于酶活性测定、底物特异性研究以及与其他蛋白质的相互作用分析，从而便于深入了解hdac11在细胞中的生物学功能。

16、3.hdac11与多种疾病息息相关，纯化的hdac11蛋白可以用于建立体外疾病模型，帮助研究疾病的发生机制和发展新的治疗策略。

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【技术保护点】

1.一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S1至S5，其中S1步骤为PEGX-6p-1-GST-homo-HDAC11(去信号肽)重组质粒构建；S2步骤为PEGX-6p-1-GST-homo-HDAC11(去信号肽)Rosetta菌诱导；S3步骤为PEGX-6p-1-GST-homo-HDAC11(去信号肽)包涵体蛋白纯化；S4步骤为GST-Beads富集GST-homo-HDAC11(去信号肽)蛋白；S5步骤为SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白的表达和纯度。

2.根据权利要求1所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S1步骤中载体构建包括设计引物、PCR扩增、酶切、连接、转化、鉴定六个子步骤。

3.根据权利要求2所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S1中的引物步骤包括使用一对特异性引物扩增HDAC11基因片段；PCR扩增步骤包括使用设计的引物和293Tcell cDNA模板进行PCR扩增得到HDAC11(去信号肽)基因片段；酶切步骤包括使用EcoRI和NotI对

4.根据权利要求2所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S1中的连接步骤包括将酶切后的homo-HDAC11(去信号肽)基因片段和PEGX-6p-1质粒进行连接反应形成重组质粒；转化步骤包括将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中并挑选出含有重组质粒的阳性克隆；鉴定步骤包括对阳性克隆进行菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。

5.根据权利要求1所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S2步骤中的Rosetta菌诱导包括将测序正确的重组质粒转化到Rosetta感受态细胞中，挑选出含有重组质粒的阳性克隆，接种到含有氨苄西林的LB液体培养基中，震荡培养至菌液OD600＝0.6-0.8，向培养基中加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续培养5h，离心收集菌体，弃去上清液，高压破碎菌体，收集GST-homo-HDAC11(去信号肽)包涵体蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S3步骤中的包涵体蛋白纯化包括裂解液重悬菌体，高压破碎菌体，收集包涵体沉淀，包涵体洗涤，包涵体溶解(变性)，梯度复性，收集复性后GST-homo-HDAC11(去信号肽)蛋白上清，包涵体洗涤包括粗洗涤和精洗涤两个步骤。

7.根据权利要求1所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S3中的包涵体洗涤液组成为20mM Tris，1mM EDTA，2M Urea，1M NaCl，1％TritonX-100，用HCl调整pH＝8。

8.根据权利要求6所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S3中的复性溶液组成为Tris 2.42g，NaCl：8.76g(1L)，复性液I为4M Urea，复性液II为2MUrea，复性液III为1M Urea，复性液IV为0M Urea。

9.根据权利要求1所述的一种内源性人源HDAC11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，S4步骤中的GST-Beads富集GST-homo-HDAC11(去信号肽)蛋白包括灭菌ddH2O清洗GST-Beads 3次，洗去酒精；

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【技术特征摘要】

1.一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，s1至s5，其中s1步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)重组质粒构建；s2步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)rosetta菌诱导；s3步骤为pegx-6p-1-gst-homo-hdac11(去信号肽)包涵体蛋白纯化；s4步骤为gst-beads富集gst-homo-hdac11(去信号肽)蛋白；s5步骤为sds-page和western blot验证蛋白的表达和纯度。

2.根据权利要求1所述的一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，s1步骤中载体构建包括设计引物、pcr扩增、酶切、连接、转化、鉴定六个子步骤。

3.根据权利要求2所述的一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，s1中的引物步骤包括使用一对特异性引物扩增hdac11基因片段；pcr扩增步骤包括使用设计的引物和293tcell cdna模板进行pcr扩增得到hdac11(去信号肽)基因片段；酶切步骤包括使用ecori和noti对pcr扩增得到的hdac11基因片段和pegx-6p-1质粒进行酶切处理。

4.根据权利要求2所述的一种内源性人源hdac11蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于，s1中的连接步骤包括将酶切后的homo-hdac11(去信号肽)基因片段和pegx-6p-1质粒进行连接反应形成重组质粒；转化步骤包括将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中并挑选出含有重组质粒的阳性克隆；鉴定步骤包括对阳性克隆进行菌落pcr鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。

5.根据权利要求1所述的一种内源性人源...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊卿，严丽君，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：

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