【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程、蛋白质工程领域，具体涉及一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体及其构建方法与应用。
技术介绍
1、葡萄糖氧化酶(god)是一种特性良好的糖蛋白，由两个相同的80kda亚基通过二硫键连接在一起，其每个亚基含有1mol紧密结合但不共价连接的fad片段作为辅助因子。god能利用分子氧为电子受体，催化d-葡萄糖(c6h12o6)氧化为d-葡萄糖内酯(c6h10o6)和过氧化氢。d-葡萄糖内酯可经非酶促水解反应生成葡萄糖酸和水。
2、葡萄糖氧化酶因为其特别的反应机制和安全的反应产物在医疗、食品、饲料等领域中得到了广泛的应用。葡萄糖氧化酶主要来源有曲霉属和青霉菌，但是目前已知的god的稳定性较差且催化活性较低，天然表达的葡萄糖氧化酶在超过55℃时，酶活力损失严重。这些缺陷极大地限制了god的应用范围，无法满足工业的需要。同时虽然国内外学家已聚焦于对酶分子进行定向进化和理性设计，但分子定向进化工作量大、随机性强而且投入成本高。而理性设计需要对god的功能结构有一定的了解，目前的god来源单一、已解析的结构少，难以进行精准的设计，所取得的成果依然不够显著。因此通过使用更多可靠的生物信息学技术来模拟和解析葡萄糖氧化酶的结构与功能，尝试对理论的关键结构和位点进行充分分析和改良，提高其催化活性和稳定性，能在很大程度上推动其在工业生产上的应用。
3、随着大型实验蛋白质数据库的访问的增加，以及高通量筛选(hts)方法和人工智能算法的进步，极大的促进了蛋白质工程。目前已经开发出一系列合理的计算机辅助学习策
技术实现思路
1、解决的技术问题：本专利技术提供一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体及其构建方法与应用，具体地，本专利技术通过对aspergillus sclerotiicarbonarius来源的asgodp关键氨基酸位点e148和v179突变后筛选，得到1种耐酸及耐热性能显著提高的葡萄糖氧化酶突变体，可以显著改良面团质构，将其应用到面包烘焙改良中具有广阔的前景。
2、技术方案：一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体，其是以野生型葡萄糖氧化酶asgodp为母本，同时将所述野生型葡萄糖氧化酶asgodp的第148位glu突变为lys，以及第179位val突变为ala得到；所述野生型葡萄糖氧化酶asgodp的氨基酸序列如seq idno.1所示，所述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、本专利技术还提供编码所述葡萄糖氧化酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、本专利技术还提供一种重组载体，其含有所述的基因。
5、本专利技术还提供一种重组菌株，其含有所述的重组载体。
6、本专利技术还提供所述的葡萄糖氧化酶突变体或所述的基因或所述的重组载体或所述的重组菌株在面包烘焙中的应用。
7、本专利技术还提供所述的葡萄糖氧化酶突变体或所述的基因或所述的重组载体或所述的重组菌株在如下任一项中的应用：
8、(1)在制备改善面团质构的发酵剂中的应用；
9、(2)在制备面包烘焙改良剂中的应用。
10、本专利技术还提供一种改善面团质构的发酵剂，其有效成分由所述的重组菌株制得。
11、本专利技术还提供一种面包烘焙改良剂，其有效成分由所述的重组菌株制得。
12、本专利技术还提供一种利用所述的重组菌株发酵生产葡萄糖突变体的方法，包括收集所述重组菌株发酵后的沉淀，并用含甲醇的诱导培养基诱导培养的步骤。
13、优选的是，所述含甲醇的诱导培养基为在所述重组菌株的发酵培养基中添加质量体积百分比为0.5％的甲醇制得，诱导培养的条件为25-35℃，100-300rpm条件下诱导培养，每隔12h补加一次甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％。
14、有益效果：本专利技术通过以来源于aspergillus sclerotiicarbonarius的葡萄糖氧化酶asgodp为母本对148位和179位的氨基酸进行定点突变后得到的一种突变体，具体通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出在耐酸性能和热稳定性两方面明显提高的葡萄糖氧化酶突变体e148k/v179a。在ph性能方面，野生酶和突变体的最适ph均为6.0，在酸性环境下(ph 2.0、3.0、4.0和5.0)突变体可以保持19％、62％、77％和86％的相对酶活，较同等条件下的野生型(5％、16％、34％和71％)分别提高2.8倍、2.9倍、1.3倍和21％；在ph稳定性方面，在酸性环境下(ph 2.0、3.0、4.0和5.0)突变体可以保持21％、60％、79％和88％的剩余酶活，较同等条件下的野生型(7％、23％、47％和73％)分别提高2.0倍、1.6倍、68％和21％，即突变酶e148k/v179a在酸性环境中的活力及耐受性明显优于野生酶。在热稳定性方面，突变体e148k/v179a的t50值为75℃，较野生酶asgodp(60℃)提高15℃；突变体e148k/v179a在75℃下半衰期(t1/2)为30min，较野生酶asgodp(6min)提高5倍；在催化性能方面，突变体e148k/v179a的比活和催化效率分别为237.5u/mg和26.3mm-1·s-1，比野生酶asgodp(比活33.67u/mg，催化效率16.15mm-1s-1)分别提高6倍和63％。本专利技术通过定点突变，获得了更加耐酸及耐热的高催化活力突变体e148k/v179a。因此，将本专利技术的耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体应用于面包烘焙行业中，具有广阔的应用前景。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其是以野生型葡萄糖氧化酶AsGODP为母本，同时将所述野生型葡萄糖氧化酶AsGODP的第148位Glu突变为Lys，以及第179位Val突变为Ala得到；所述野生型葡萄糖氧化酶AsGODP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。
4.一种重组菌株，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组载体。
5.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌株在面包烘焙中的应用。
6.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌株在如下任一项中的应用：
7.一种改善面团质构的发酵剂，其特征在于，其有效成分由权利
8.一种面包烘焙改良剂，其特征在于，其有效成分由权利要求4所述的重组菌株制得。
9.一种利用权利要求4所述的重组菌株发酵生产葡萄糖突变体的方法，其特征在于，包括收集所述重组菌株发酵后的沉淀，并用含甲醇的诱导培养基诱导培养的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含甲醇的诱导培养基为在所述重组菌株的发酵培养基中添加质量体积百分比为0.5％的甲醇制得，诱导培养的条件为25-35℃，100-300rpm条件下诱导培养，每隔12h补加一次甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％。
...【技术特征摘要】
1.一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其是以野生型葡萄糖氧化酶asgodp为母本，同时将所述野生型葡萄糖氧化酶asgodp的第148位glu突变为lys，以及第179位val突变为ala得到；所述野生型葡萄糖氧化酶asgodp的氨基酸序列如seq idno.1所示，所述葡萄糖氧化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.编码权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。
4.一种重组菌株，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组载体。
5.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌株在面包烘焙中的应用。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭映芝，赵怡凡，何晓晓，游帅，赵卫国，王俊，杨乐云，李龙，赵梦迪，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。