【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开提供了包含核酸单链夹板链的组合物以及使用单链夹板链的方法。单链夹板链可以与文库分子的部分杂交以形成具有缺口的文库-夹板复合物，其中缺口可以被连接以形成共价闭合环状分子，该共价闭合环状分子经历下游扩增和测序工作流程。
技术介绍
1、本公开涉及从共价闭合环状分子文库制备多核苷酸并对其进行测序。二代测序技术的改进极大地提高了测序速度和数据输出，由此导致当前测序平台的高样品通量。有效制备具有靶序列的闭合环状文库分子对于下游扩增和测序工作流程非常重要。提高测序通量的另一个方面是在文库制备过程中向dna片段添加唯一索引序列，这允许在每次测序运行期间汇集大量文库并同时进行测序。因此，需要用于产生和测序含有靶序列和唯一索引序列的环状文库分子的替代方法，其与下游二代测序技术兼容。本文提供了满足这种需要的组合物、方法和试剂盒。
技术实现思路
1、本公开提供了文库-夹板复合物(300)，其包含：(i)单链核酸文库分子(100)，其包括目的序列(110)，该目的序列在一侧上侧接至少第一左通用衔接子序列(120)，并且在另一侧上侧接至少第一右通用衔接子序列(130)；以及(ii)单链夹板链(200)，其包括第一区域(210)，该第一区域具有针对文库分子的第一左通用衔接子序列(120)的通用结合序列，并且该单链夹板链进一步包含第二区域(220)，该第二区域具有针对文库分子的第一右通用衔接子序列(130)的通用结合序列，由此使文库分子成环以产生文库-夹板复合物(300)，该文库-夹板复合物在文库分子的5'
2、在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第二左通用衔接子序列(140)。在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第二右通用衔接子序列(150)。在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第一左样品索引序列(160)。在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第一右样品索引序列(170)。在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第一左唯一识别序列(180)。在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含：第一右唯一识别序列(190)。
3、在一些实施例中，核酸文库分子(100)进一步包含以下任意一者或者两者或更多者的任意组合：(i)第二左通用衔接子序列(140)；(ii)第二右通用衔接子序列(150)；(iii)第一左索引序列(160)；(iv)第一右索引序列(170)；(v)第一左唯一识别序列(180)；和/或(vi)第一右唯一识别序列(190)。
4、在一些实施例中，第一左通用衔接子序列(120)和/或第二左通用衔接子序列(140)包括：(i)针对正向测序引物的通用结合序列；(ii)针对反向测序引物的通用结合序列；(iii)针对第一表面引物的通用结合序列；(iv)针对第二表面引物的通用结合序列；(v)针对正向扩增引物的通用结合序列；(vi)针对反向扩增引物的通用结合序列；和/或(vii)针对压实寡核苷酸的通用结合序列。
5、在一些实施例中，第一右通用衔接子序列(130)和/或第二右通用衔接子序列(150)包括：(i)针对正向测序引物的通用结合序列；(ii)针对反向测序引物的通用结合序列；(iii)针对第一表面引物的通用结合序列；(iv)针对第二表面引物的通用结合序列；(v)针对正向扩增引物的通用结合序列；(vi)针对反向扩增引物的通用结合序列；和/或(vii)针对压实寡核苷酸的通用结合序列。
6、本公开提供了一种用于产生多个共价闭合环状文库分子(400)的方法，其包括：a)提供多个单链核酸文库分子(100)，其中多个单链核酸文库分子中的各个文库分子包括目的序列(110)，该目的序列在一侧上侧接至少第一左通用衔接子序列(120)，并且在另一侧上侧接至少第一右通用衔接子序列(130)；b)提供多个单链夹板链(200)，其中该多个单链夹板链中的各个单链夹板链(200)包括第一区域(210)和第二区域(220)，该第一区域能够与各个文库分子的至少第一左通用衔接子序列(120)杂交，该第二区域能够与各个文库分子的至少第一右通用衔接子序列(130)杂交；c)使多个单链夹板链(200)与多个单链核酸文库分子(100)杂交，使得单链夹板链(210)中的一个的第一区域退火至文库分子的至少第一左通用衔接子序列(120)，并且使得单链夹板链(220)的第二区域退火至文库分子的至少第一右通用序列(130)，由此使各个文库分子成环以形成多个文库-夹板复合物(300)，该文库-夹板复合物在文库分子的末端5'与3'端之间具有缺口，其中该缺口是可酶促连接的；以及d)连接多个文库-夹板复合物(300)中的缺口，由此产生多个共价闭合环状文库分子(400)。
7、在一些实施例中，该方法进一步包括：(e)在适用于使各个共价闭合环状文库分子(400)与各个固定的表面引物杂交的条件下，将多个共价闭合环状文库分子(400)分配到支持物上，该支持物具有固定在支持物上的多个表面引物，由此将多个共价闭合环状文库分子(400)固定到支持物。
8、在一些实施例中，该方法进一步包括：(f)在适合于使用多个表面引物作为固定的扩增引物并使用多个共价闭合环状文库分子(400)作为模板分子，在支持物上进行滚环扩增反应的条件下，使多个固定的共价闭合环状文库分子(400)与多个链置换聚合酶和多个核苷酸接触，由此产生多个固定的核酸多联体分子。
9、在一些实施例中，该方法进一步包括：对多个固定的核酸多联体分子进行测序。在一些实施例中，测序包括：a)使多个固定的多联体分子与(i)多个测序聚合酶和(ii)多个可溶性测序引物接触，其中该接触在适合于形成各自包含结合至核酸双链体的测序聚合酶的多个复合聚合酶的条件下进行，其中核酸双链体包含与可溶性测序引物杂交的多联体分子；b)在适用于将至少一个核苷酸与复合测序聚合酶结合的条件下，使多个复合测序聚合酶与多个核苷酸接触，其中该多个核苷酸包括至少一个用荧光团标记并在糖3'位置处具有可移除链终止部分的核苷酸类似物；c)将至少一个核苷酸掺入到杂交的测序引物的3'端中，由此产生多个新生的延伸的测序引物；以及d)检测掺入的核苷酸并识别掺入的核苷酸的核碱基。
10、在一些实施例中，测序包括：a)使多个固定的多联体分子与(i)多个测序聚合酶和(ii)多个可溶性测序引物接触，其中该接触在适合于形成各自包含结合至核酸双链体的测序聚合酶的多个第一复合聚合酶的条件下进行，其中该核酸双链体包含与可溶性测序引物杂交的多联体分子；b)在适用于将多价分子的互补核苷酸单元与多个第一复合聚合酶中的至少两个结合以形成多个多价-复合聚合酶的条件下，使多个复合测序聚合酶与多个可检测地标记的多价分子接触，由此形成多个多价-复合聚合酶，并且该条件抑制互补核苷酸单元掺入到多个多价-复合聚合酶的测序引物中，其中多个多价分子中的各个多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心，并且每个核苷酸臂附接至核苷酸单元；c)检测多个多价-复合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种文库-夹板复合物(300)，其包含：
2.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二左通用衔接子序列(140)。
3.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二右通用衔接子序列(150)。
4.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左样品索引序列(160)。
5.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右样品索引序列(170)。
6.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左唯一识别序列(180)。
7.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右唯一识别序列(190)。
8.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含以下任意一者
9.根据权利要求8所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述第一左通用衔接子序列(120)和/或所述第二左通用衔接子序列(140)包括：
10.根据权利要求8所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述第一右通用衔接子序列(130)和/或所述第二右通用衔接子序列(150)包括：
11.一种用于产生多个共价闭合环状文库分子(400)的方法，其包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括：(e)在适用于使各个共价闭合环状文库分子(400)与各个固定的表面引物杂交的条件下，将所述多个共价闭合环状文库分子(400)分配到支持物上，所述支持物具有固定在所述支持物上的多个表面引物，由此将所述多个共价闭合环状文库分子(400)固定到所述支持物。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括：(f)在适合于使用多个表面引物作为固定的扩增引物并使用所述多个共价闭合环状文库分子(400)作为模板分子在所述支持物上进行滚环扩增反应的条件下，使多个固定的共价闭合环状文库分子(400)与多个链置换聚合酶和多个核苷酸接触，由此产生多个固定的核酸多联体分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括：对所述多个固定的核酸多联体分子进行测序。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述测序包括：
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述测序包括：
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括：
19.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括：
20.一种形成至少一种亲和力复合物的方法，其包括：
21.一种通过形成至少一种亲和力复合物进行测序的方法，其包括：
22.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二左通用衔接子序列(140)。
23.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二右通用衔接子序列(150)。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左样品索引序列(160)。
25.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右样品索引序列(170)。
26.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左唯一识别序列(180)。
27.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右唯一识别序列(190)。
28.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含以下任意一者或者两者或更多者的任意组合：
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一左通用衔接子序列(120)和/或所述第二左通用衔接子序列(140)包括：
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一右通用衔接子序列(130)和/或所述第二右通用衔接子序列(150)包括：
31.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
32.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(b)的所述平衡多样性是在所述第一测序循环、所述第二测序循环和所述第三测序循环中的每一者中检测和成像的所述核碱基A、G、C和T/U中的每一者的25-75％。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种文库-夹板复合物(300)，其包含：
2.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二左通用衔接子序列(140)。
3.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二右通用衔接子序列(150)。
4.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左样品索引序列(160)。
5.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右样品索引序列(170)。
6.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左唯一识别序列(180)。
7.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右唯一识别序列(190)。
8.根据权利要求1所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含以下任意一者或者两者或更多者的任意组合：
9.根据权利要求8所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述第一左通用衔接子序列(120)和/或所述第二左通用衔接子序列(140)包括：
10.根据权利要求8所述的文库-夹板复合物(300)，其中所述第一右通用衔接子序列(130)和/或所述第二右通用衔接子序列(150)包括：
11.一种用于产生多个共价闭合环状文库分子(400)的方法，其包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括：(e)在适用于使各个共价闭合环状文库分子(400)与各个固定的表面引物杂交的条件下，将所述多个共价闭合环状文库分子(400)分配到支持物上，所述支持物具有固定在所述支持物上的多个表面引物，由此将所述多个共价闭合环状文库分子(400)固定到所述支持物。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括：(f)在适合于使用多个表面引物作为固定的扩增引物并使用所述多个共价闭合环状文库分子(400)作为模板分子在所述支持物上进行滚环扩增反应的条件下，使多个固定的共价闭合环状文库分子(400)与多个链置换聚合酶和多个核苷酸接触，由此产生多个固定的核酸多联体分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括：对所述多个固定的核酸多联体分子进行测序。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述测序包括：
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述测序包括：
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括：
19.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括：
20.一种形成至少一种亲和力复合物的方法，其包括：
21.一种通过形成至少一种亲和力复合物进行测序的方法，其包括：
22.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二左通用衔接子序列(140)。
23.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第二右通用衔接子序列(150)。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左样品索引序列(160)。
25.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右样品索引序列(170)。
26.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一左唯一识别序列(180)。
27.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含：第一右唯一识别序列(190)。
28.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸文库分子(100)进一步包含以下任意一者或者两者或更多者的任意组合：
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一左通用衔接子序列(120)和/或所述第二左通用衔接子序列(140)包括：
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一右通用衔接子序列(130)和/或所述第二右通用衔接子序列(150)包括：
31.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
32.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(b)的所述平衡多样性是在所述第一测序循环、所述第二测序循环和所述第三测序循环中的每一者中检测和成像的所述核碱基a、g、c和t/u中的每一者的25-75％。
33.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述多个核酸模板分子进一步包含第二样品索引，所述第二样品索引包含识别所述插入序列的所述样品源的第二通用样品索引序列，并且所述第二样品索引缺少随机序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括：
36.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
37.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(b)的所述平衡多样性是在所述第一测序循环、所述第二测序循环、所述第三测序循环和所述第四测序循环中的每一者中检测和成像的所述核碱基a、g、c和t/u中的每一者的25-75％。
38.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括：
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述多个核酸模板分子进一步包含第二样品索引，所述第二样品索引包含识别所述插入序列的所述样品源的第二通用样品索引序列，并且所述第二样品索引缺少随机序列。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括：
41.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述支持物包括玻璃或塑料基底。
42.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述支持物被配置在流通池通道、流通池或毛细管腔上。
43.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述支持物用具有不大于45度的水接触角的至少一个亲水性聚合物涂层钝化。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含选自由以下项组成的组的分子：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(phema)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少四个支链的支链亲水性聚合物分子。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含具有至少1000道尔顿的分子量的聚合物分子。
47.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述固定的模板分子包含具有所述一个样品索引和所述插入序列的串联重复序列的多个固定的多联体分子。
48.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述固定的模板分子包含多个不同的成簇模板分子，所述成簇模板分子具有所述插入序列的一个拷贝和所述一个样品索引的一个拷贝，其中所述成簇模板分子经由桥式扩增产生。
49.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中位于所述支持物上的随机位置处的所述固定的核酸模板分子的密度为104-108个/mm2。
50.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述插入序列的所述样品源是基因组dna、双链cdna或细胞游离循环dna。
51.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含各自包含芳香族核碱基、五碳糖部分、1-10个磷酸酯基团和荧光团的核苷酸。
52.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含各自包含芳香族核碱基、在3'碳糖位置处具有链终止基团的五碳糖部分、1-10个磷酸酯基团和荧光团的核苷酸。
53.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含多价分子，每个多价分子包含(1)核心、(2)多个核苷酸臂和(3)至少一个荧光团，其中各个核苷酸臂包含(i)核心附接部分、(ii)包含peg部分的间隔基、(iii)接头和(iv)核苷酸单元，其中所述核心附接至所述多个核苷酸臂，其中所述间隔基附接至所述接头，其中所述接头附接至所述核苷酸单元。
54.根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中结合至所述固定的模板分子的所述可检测地标记的核苷酸试剂包含与测序引物杂交以形成双链体的各个固定的模板分子，并且所述双链体结合至聚合酶以形成复合聚合酶，并且所述复合聚合酶结合至可检测地标记的核苷酸试剂。
55.根据权利要求54所述的方法，其中在适用于将可检测地标记的核苷酸试剂与所述复合聚合酶结合并将所述可检测地标记的核苷酸掺入到杂交的测序引物中的条件下，所述复合聚合酶结合至所述可检测地标记的核苷酸试剂，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含芳香族核碱基、五碳糖部分、1-10个磷酸酯基团和荧光团。
56.根据权利要求54所述的方法，其中在适用于将可检测地标记的核苷酸试剂与所述复合聚合酶结合并将所述可检测地标记的核苷酸掺入到杂交的测序引物中的条件下，所述复合聚合酶结合至所述可检测地标记的核苷酸试剂，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含芳香族核碱基、在3'碳糖位置处具有链终止基团的五碳糖部分、1-10个磷酸酯基团和荧光团。
57.根据权利要求54所述的方法，其中在适用于将可检测地标记的核苷酸试剂与所述复合聚合酶结合的条件下，所述复合聚合酶结合至所述可检测地标记的核苷酸试剂，并且所述条件适用于抑制核苷酸掺入，其中所述可检测地标记的核苷酸试剂包含多价分子，所述多价分子包括(1)核心、(2)多个核苷酸臂和(3)至少一个荧光团，其中各个核苷酸臂包含(i)核心附接部分，(ii)包含peg部分的间隔基，(iii)接头和(iv)核苷酸单元，其中所述核心附接至所述多个核苷酸臂，其中所述间隔基附接至所述接头，其中所述接头附接至所述核苷酸单元。
58.根据权利要求54所述的方法，其中所述固定的模板分子包含固定的多联体分子，所述固定的多联体分子与多个测序引物杂交以在同一多联体分子上形成至少第一双链体和第二双链体，其中所述第一和双链体结合至第一聚合酶并且所述第二双链体结合至第二聚合酶，以形成第一复合聚合酶和第二复合聚合酶，并且其中所述方法包括：
59.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
60.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)的所述平衡多样性是在所述第一测序循环、所述第二测序循环和所述第三测序循环中的每一者中检测和成像的所述核碱基a、g、c和t/u中的每一者的25-75％。
61.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括：
62.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括：
63.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
64.根据权利要求63所述的方法，其中步骤(e)的所述平衡多样性是在所述第一测序循环、所述第二测序循环、所述第三测序循环和所述第四测序循环中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：W·莱特，R·凯利，J·赵，
申请(专利权)人：元素生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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