【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物，特别是涉及一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、放疗、化疗和靶向治疗等常规疗法已广泛应用于临床，是肿瘤的常见治疗手段，但仍具有局限性。放疗和化疗的靶向性较差,易损害正常组织，易产生耐药性。靶向疗法针对性强，副作用小，但适用范围有限，疗效因个体差异而异，治疗费用高昂。靶向代谢是一种选择性作用于肿瘤细胞的新手段，由于肿瘤细胞通常发生代谢谱的改变，肿瘤细胞与正常细胞间差异性表达的代谢相关表型和基因可作为肿瘤代谢治疗的关键靶点。然而，代谢靶向药物的治疗效果受到其对免疫细胞的脱靶毒性和高剂量介导的副作用的限制。因此，本专利技术提出了一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法及其应用。
技术实现思路
1、针对
技术介绍
中提到的技术问题，本专利技术提出一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法及其应用。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
4、将15mg的人参皂苷rg3、50mg的pl-100m共同溶解于10ml无水乙醇，随后转移至茄形瓶中，减压旋转蒸发至溶剂挥干，瓶壁可见均匀薄膜；
5、将5mg半胱氨酸(cysteine)、0.5g葡萄糖溶于10ml纯水中，将水溶液加入至茄形瓶中，超声水化，至薄膜完全脱落，得到脂质体粗混悬液；
6、混悬液用探头超声仪在270w下超声30次(工作时间5s，间歇时间5s，保护温度25℃)，形成rg3-lp/cys
7、本专利技术的另一目的在于提供一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的rg3-lp/cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用。
8、作为本专利技术进一步的技术方案，所述应用包括：
9、体内药效评价：建立并使用了4t1荷瘤小鼠模型，将2×106个4t1细胞悬浮于rpmi-1640培养基中接种于balb/c雌性小鼠右侧背部皮下，用数字卡尺测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积，当原位肿瘤体积增至50-100mm3时，将小鼠随机分为3组(n＝5)：control、rg3+cysteine和rg3-lp/cysteine；每只小鼠尾静脉给予药物(rg3：1500μg/ml，200μl)，每2天静脉注射1次，共注射3次，治疗期间每隔一天记录小鼠肿瘤体积和体重，当肿瘤体积大于2000mm3或者小鼠死亡时认定小鼠死亡，17天后，处死实验动物，计算肿瘤体积抑制率tir。
10、作为本专利技术进一步的技术方案，所述应用包括：
11、体外细胞毒性实验：采用cck-8比色法检测rg3-lp/cysteine对乳腺癌细胞4t1、黑色素瘤细胞b16、肺癌细胞llc和结肠癌细胞ct26的肿瘤细胞毒性，细胞以每孔1×104(100μl)个细胞接种于96孔板，培养过夜，细胞黏附后，使用培养基稀释c-lp、rg3、cysteine、rg3-lp/cysteine或rg3+cysteine(游离药物)；每孔加入100μl(rg3：15μg/ml)，继续培养36h后，去掉培养基，加入100μl含10％cck-8培养基继续孵育2h，用酶标仪记录细胞在450nm处的od值，此外，采用小鼠乳腺上皮细胞hc11考察rg3-lp/cysteine对小鼠正常细胞的毒性。
12、作为本专利技术进一步的技术方案，所述应用包括：
13、肌动蛋白的荧光染色：以肿瘤细胞4t1、ct26及正常细胞hc11作为模型细胞，将模型细胞以每培养皿1.5×105个细胞的密度接种在20mm玻底培养皿中，于培养箱中孵育过夜，细胞黏附后，弃去原培养液，分别用2ml含pbs、rg3+cysteine、rg3-lp/cysteine培养基(rg3：15μg/ml)处理细胞，在37℃培养箱中孵育4h后，移除培养液并用pbs(ph7.4)洗涤2次，用4％多聚甲醛冰上固定15min，被固定细胞用破膜液在室温下透化5min，然后用pbs洗涤两次，细胞在鬼笔环肽中室温避光孵育20min，对肌动蛋白进行染色，最后用dapi对细胞进行封固同时对细胞和染色，利用激光共聚焦显微镜进行观察。
14、作为本专利技术进一步的技术方案，所述应用包括：
15、nadp(h)测定：以肿瘤细胞4t1、ct26及正常细胞hc11作为模型细胞，细胞内nadph和nadp(h)total(nadph+nadp+)利用nadp+/nadph检测试剂盒(wst-8)测量，细胞以每孔4×105(2ml)个细胞接种于6孔板，细胞长满后，吸净培养液，每孔加入200μl的nadp+/nadph提取液并轻轻吹打，促进细胞的裂解，裂解液离心10min(12000g，4℃)，吸取50μl上清至96孔板中，每孔加入100μlg6pdh工作液，37℃避光孵育10min，每孔加入10μl显色液，混匀，37℃避光孵育30min，测量450nm处吸光度，测得nadp(h)total；
16、裂解液离心后60℃水浴加热30min，按照上述方法测定可得nadph含量，随后通过nadp(h)total减去nadph计算nadp+的浓度。
17、本专利技术的有益效果是：
18、本专利技术提供了一种基于双硫死亡策略的广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法及其应用，双硫死亡不同于其他现有形式的细胞死亡，是一种新形式的调节性细胞死亡(rcd)，揭示了生物体对抗肿瘤恶性进展的新机制，为肿瘤研究和治疗提供新的视角和靶点。双硫死亡主要基于nadph产生的抑制及随后二硫化物胱氨酸的累积诱导的肌动蛋白的皱缩，以葡萄糖饥饿为先决条件，抑制glut1对葡萄糖摄取的药理学阻断会诱导肿瘤细胞死亡。利用rg3作为脂质体膜稳定剂插入双层磷脂时，暴露的糖基可与肿瘤细胞表面glut1结合，抑制肿瘤细胞通过glut1对葡萄糖的摄取，抑制肿瘤细胞内nadph积累，促进二硫化物应激。本专利技术首次利用rg3的glut1靶向结合性，研究其基于糖代谢干扰的抗肿瘤作用，是rg3抗肿瘤研究的新视角。
19、2000年，rg3在中国被开发并批准为参益胶囊，作为临床一线抗癌药物。大量临床试验表明，参益胶囊显著提高了化疗的治疗效果，减少了化疗的副作用，说明rg3安全性。与高度选择性的glut1抑制剂相比，避免了对免疫细胞和正常细胞的脱靶毒性和高剂量介导的副作用。半胱氨酸是身体必需的氨基酸，是氨基酸代谢的中间产物，为各种细胞正常活动所需，不具毒性，仅在葡萄糖饥饿导致的氧化环境中被氧化为胱氨酸，从而导致二硫化物累积，产生二硫应激，导致细胞死亡。因此，由于rg3和半胱氨酸的安全性及其简单的制剂设计，本专利技术不存在放化疗等抗肿瘤疗法的副作用。
20、本专利技术利用新型细胞死亡类型-双硫死亡，靶向于肿瘤代谢，靶点为在肿瘤细胞表面普遍高表达的glut1，纳米脂质体的抗肿瘤作用具有广谱性且对正常组织无影响。
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1.一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.一种如权利要求1所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的Rg3-Lp/Cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的Rg3-Lp/Cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括：
4.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的Rg3-Lp/Cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括：
5.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的Rg3-Lp/Cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括：
6.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的Rg3-Lp/Cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括：
【技术特征摘要】
1.一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.一种如权利要求1所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的rg3-lp/cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂质体的制备方法制备的rg3-lp/cysteine脂质体在抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述应用包括：
4.根据权利要求2所述的一种广谱抗肿瘤纳米脂...
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