【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药工程，具体涉及一种靶向2型糖尿病相关蛋白fabp4的高亲和力拟抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、抗体是免疫系统在抗原刺激下，由b淋巴细胞或记忆b细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)。无论在生物
，还是疾病的诊断与治疗方面，抗体都发挥着广泛而重要的作用，相关研究领域也成为了研究热点。抗体的优势主要体现在高度特异性、多样化及靶向专一等方面，然而随着研究的深入，其天然局限性也凸显出来：①抗体体积较大，对组织、实体瘤穿透性较差；②抗原结合部位fv区域较小会导致轻链和重链结合不稳定，重组表达步骤过于困难，制约了其应用范围；③fv区域由重链和轻链的6个抗体可变区组成，在制备全合成抗体库时结构多样性受限；④糖基化的抗体药物必须在真核细胞株内表达，周期长成本高。
2、基于抗体的种种不足，寻找类抗体骨架蛋白药物(antibody-like scaffolddrug)或非抗体骨架蛋白药物(non-antibody scaffold drug)逐渐成为了新的基础研究热点和技术创新点。理想的非抗体骨架蛋白一般具有较小的体积，致密且热稳定的结构，以及可变的表面区域。类抗体骨架药物与传统的抗体药物相比，具有胞内稳定、弱免疫效应、口服吸收和低成本等重要特性，成为药物研发的热点领域之一。
3、蛋白模拟物(protein mimetics)是在生物学功能上模拟其它蛋白的作用或者活性的一些多肽、修饰的肽或者其它分子，通常用于药物设计和发
4、拟抗体的蛋白骨架(protein scaffold)是从基因改造构建而成的骨架蛋白库中针对特定的靶分子筛选而得到的，近年来相关研究得到长足的发展。军事医学科学院在骨架蛋白的研究和开发做出了探索研究，杜建芳等以硫氧还蛋白trx为骨架，在起突环区插入随机肽库片段构建骨架蛋白多肽库，赵安等将分子改造后的昆虫防御素a展示到噬菌体表面。2009年美国fda批准了dyax制造的kalbitor(ecallantide)用于防止遗传性血管性水肿的发作，2017年5月阿斯利康将波士顿pieris phamaceuticals公司的anticalin哮喘药物prs-060(拟抗体)投向临床；2019年3月可口服的抗流感拟抗体应用于小鼠研究取得进展，该拟抗体靶向流感ha(hemagglutinin，血凝素)上保守表位，在体外和体内具备了抗体功能特征，并展现出与流感中和抗体cr6261相当的高亲和力和广谱结合活性。
5、微生物蛋白是拟抗体骨架的重要来源，如affibody的骨架来自金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus protein a的z结构域，affitin的骨架来自嗜酸热硫化叶菌sulfolobus acidocaldarius的sac7d蛋白，可见微生物来源的蛋白骨架在拟抗体骨架的开发中发挥了重要的作用。芽孢杆菌可以在高温、盐碱等环境下存活，有些菌株甚至直接分离自极端环境，常被用作筛选极端环境下具有耐受性的酶的来源。
6、来源于芽孢杆菌bacillus licheniformis atcc 14580的纤维素酶cel5b(pdbid：4yzp)与来源于b.halodurans的纤维素酶cel5b(pdb id：4v2x)、来源于bacillus sp.bg-cs10的纤维素酶celb(pdb id：5e0c)的蛋白质结构一样含有3个结构域，在催化结构域与碳水化合物结合模块cbm46之间存在一个额外的ig-like结构域。ig-like折叠是自然界中普遍存在的折叠方式之一，不仅在抗体，在其它许多蛋白中也存在，如钙粘蛋白结构域采用ig-like折叠的拓扑结构。我们通过结构比较分析发现纤维素酶这类三结构域纤维素酶的ig-like结构域与抗体片段(单域抗体vh、纳米抗体ch2和ch3)具有结构相似性，可以对其3个loop区(结构上对应于抗体的互补决定区complementarity determining region，cdr)进行设计开发成拟抗体骨架，具有改造成为拟抗体底层骨架的天然优势。
7、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，fabp4)，也称作脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，a-fabp)或脂肪细胞蛋白2(adpocyte protein 2，ap2)，在多个物种中均有表达，是一种保守性很强的蛋白，主要负责促进脂质的储存、分布、运输、分解和代谢。fabp4促进了脂肪酸在细胞内部的运输与存储，对脂肪组织的能量均衡起到重要作用；可通过辅助脂肪酸的动员，使脂肪酸能够作为能量来源在禁食或能量需求高的情况下得以利用从而调节脂类代谢；此外还可以与维生素a以及类十二烷酸结合。fabp4蛋白含有一个疏水性口袋，专门用来绑定长链脂肪酸。体内高于正常水平的fabp4是导致代谢疾病的原因之一，可导致心血管疾病、呼吸系统疾病、神经系统障碍等疾病。fabp4水平的升高可能加剧胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良，已被列为2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，t2dm)与冠心病(coronary heart disease，chd)的常见危险因素。
8、因此，通过检测fabp4水平可用于预测和诊断代谢性疾病(如2型糖尿病和冠心病)，评估疾病风险以及监测治疗效果，为相关疾病的早期干预及治疗过程评估提供科学依据。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种靶向2型糖尿病相关蛋白fabp4的高亲和力拟抗体及其制备方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术首先提供了基于地衣芽孢杆菌纤维素酶ig-like结构域构建的拟抗体骨架cbody，所述拟抗体骨架cbody为ig-like结构域蛋白的四突变体，其氨基酸序列如seq idno.6所示；所述拟抗体骨架cbody具有3个类似于抗体互补决定簇功能的抗原结合loop本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于地衣芽孢杆菌纤维素酶Ig-like结构域构建的拟抗体骨架CBody，其特征在于，所述拟抗体骨架CBody为Ig-like结构域蛋白的四突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.基于权利要求1所述的拟抗体骨架CBody的拟抗体文库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种靶向2型糖尿病相关蛋白FABP4的拟抗体6F6@CBody，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
4.如权利要求3所述的一种靶向2型糖尿病相关蛋白FABP4的拟抗体6F6@CBody的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.一种抗原结合片段或拟抗体衍生物，其特征在于：其为下述A1)或A2)：
6.一种生物材料，其特征在于，其为下述任意一种：
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：如B1)所述核酸分子具有3个抗原结合loop区：loop1，loop2和loop3，所述loop1的编码基因是SEQ IDNo.7的第82-105位；所述loop2的编码基因
8.根据权利要求6或7所述的生物材料，其特征在于：如B1)所述核酸分子为如下任一种：
9.一种靶向2型糖尿病相关蛋白FABP4的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求3所述的拟抗体6F6@CBody，或包含权利要求5所述的抗原结合片段或拟抗体衍生物，或包含权利要求6所述的生物材料。
10.下述任意一种应用：
...【技术特征摘要】
1.基于地衣芽孢杆菌纤维素酶ig-like结构域构建的拟抗体骨架cbody，其特征在于，所述拟抗体骨架cbody为ig-like结构域蛋白的四突变体，其氨基酸序列如seq id no.6所示。
2.基于权利要求1所述的拟抗体骨架cbody的拟抗体文库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.一种靶向2型糖尿病相关蛋白fabp4的拟抗体6f6@cbody，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
4.如权利要求3所述的一种靶向2型糖尿病相关蛋白fabp4的拟抗体6f6@cbody的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.一种抗原结合片段或拟抗体衍生物，其特征在于：其为下述a1)或a2)：
6.一种生物材料，其特征在于，...
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