【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别涉及一种突变型p17短肽及其在纳米抗体制备中的应用。
技术介绍
1、纳米抗体(nanobody，nb)是一类只含重链可变区(vhh)的单域抗体，存在于骆驼及一些软骨鱼类体内，是已知的可结合目标抗原的最小单位，其分子量只有15kda。纳米抗体具有分子质量小、组织穿透力强、免疫原性低、人源化简单、抗原结合亲和力高、在极端条件稳定性好且易于重组表达与生产等诸多优点，在生物医药、食品安全检测以及疾病诊断和治疗等领域备受关注。
2、纳米抗体的基因序列相对简单，只涉及重链可变区的编码序列，这使得基于基因工程技术大规模发酵生产纳米抗体具有很大的优势。目前大肠杆菌表达系统是应用较多的纳米抗体表达系统，大肠杆菌作为传统模式生物之一，因其繁殖速度快、遗传背景透彻、易于基因操作，是实验室和工业生产表达异源蛋白的首选宿主。然而，由于大肠杆菌是原核生物，缺乏真核生物中的翻译后修饰机制，易引起抗体的表达量低、可溶性差以及形成无活性或低活性的包涵体等，这导致抗体需要在纯化后经过复杂的复性步骤且进一步容易造成表达产物降解的问题。因此，提高纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性表达是实现其广泛应用的关键之一。
3、通过融入可溶性表达标签，即在目的蛋白的n端或c端融合某种或多种促溶标签，例如麦芽糖结合蛋白(mbp)、小泛素样修饰蛋白(sumo)和氮源利用物质a(nusa)，帮助目的蛋白正确折叠，可以实现提高表达产物的可溶性表达水平。然而，这些体积较大的标签如mbp可能会对抗体与抗原相互作用产生空间干扰，需在表达纯化后切除标
4、p17蛋白是t7噬菌体尾部的一种纤维蛋白，通过一段由33个氨基酸组成的多肽(称作p17肽或标签)与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白(lrp)特异性结合，能够将噬菌体颗粒和小分子、蛋白、核酸以及脂质体等靶向运送到肝细胞。这种特性使得p17标签在抗体表达中具有独特的应用价值。p17标签具有提高抗体表达溶解度、增强稳定性和提高抗原结合能力等显著优势。尽管p17蛋白在抗体表达中展现出了良好的应用潜力，但仍面临一些挑战。如何进一步优化p17标签的结构和功能，以提高其在不同抗体表达系统中的适用性和可溶性表达效率是当前工作中的重中之重。
技术实现思路
1、针对现有技术的p17短肽标签，本专利技术通过点突变优化其氨基酸序列，提供了一种新型的p17短肽，该突变型p17短肽具有良好的分子伴侣样活性和促溶效应，能够有效提高纳米抗体在原核表达系统中的溶解性和表达效率，大大提高纳米抗体的可溶性表达产量而且有助于保持其生物学活性。由此本专利技术进一步提供了该突变型p17短肽在制备纳米抗体中的应用。本专利技术具体通过以下技术方案实现：
2、本专利技术的第一方面提供了一种突变型p17短肽，所述突变型p17短肽的氨基酸序列为kgfrdekkrfkntkg。
3、本专利技术的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如上所述的突变型p17短肽的基因序列。
4、进一步地，编码所述突变型p17短肽的基因(dna)序列为aagggcttcagagacgaaaaaaagaggttcaagaacacgaagggc。
5、进一步地，所述核酸分子还包括编码纳米抗体的基因序列。
6、进一步地，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.5或seq id no.6所示。
7、进一步地，所述核酸分子还包括编码纯化标签的基因序列，所述纯化标签选自6×his、8×his、trx、3×flag、gst、strep(ii)、ha、gfp、cmyc、mfc中的一种或多种。
8、本专利技术的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括如上所述的核酸分子。
9、进一步地，所述表达载体为pet22b载体，所述核酸分子插入所述pet22b载体的bamh i和xho i酶切位点间。
10、本专利技术第四方面提供了如上所述的突变型p17短肽、核酸分子或者表达载体在制备纳米抗体中的应用。
11、本专利技术第五方面提供了一种纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
12、s1、将编码突变型p17短肽的基因序列和编码纳米抗体的基因序列连接到表达载体的多克隆位点间，获得重组表达载体；
13、s2、将所述重组表达载体导入原核细胞，培养一段时间后收获原核细胞进行细胞破碎，之后收集细胞破碎上清液进行纯化，得到所述纳米抗体。
14、本专利技术的优点及积极效果为：
15、本专利技术提供的突变型p17短肽具有良好的分子伴侣样活性和促溶效应，且对不同纳米抗体株具有良好的适用性，将其与纳米抗体融合并在原核表达系统进行表达，可有效提高纳米抗体在原核表达系统中的溶解性和表达效率，在相同的培养体系和培养条件下，本专利技术突变型p17短肽促溶表达所得的可溶纳米抗体产量和纯化所得抗体总量约为野生型p17短肽(未突变)的4-6倍，大大提高了纳米抗体的可溶性产量；而且添加本专利技术突变型p17短肽有助于保持抗体生物学活性，得到高活性和高表达量的纳米抗体，后续无需除去本专利技术突变型p17短肽标签即可直接应用，大大简化了纳米抗体的制备程序；本专利技术为纳米抗体的大规模生产创造了有利条件，具有广阔的应用前景。
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1.一种突变型P17短肽，其特征在于，其氨基酸序列为KGFRDEKKRFKNTKG。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码如权利要求1所述的突变型P17短肽的基因序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，编码所述突变型P17短肽的基因序列为AAGGGCTTCAGAGACGAAAAAAAGAGGTTCAAGAACACGAAGGGC。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括编码纳米抗体的基因序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括编码纯化标签的基因序列，所述纯化标签选自6×His、8×His、Trx、3×FLAG、GST、strep(II)、HA、GFP、cMyc、mFC中的一种或多种。
7.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求2-6任一项所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其
9.如权利要求1所述的突变型P17短肽、如权利要求2-6任一项所述的核酸分子或者如权利要求7-8任一项所述的表达载体在制备纳米抗体中的应用。
10.一种纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种突变型p17短肽，其特征在于，其氨基酸序列为kgfrdekkrfkntkg。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码如权利要求1所述的突变型p17短肽的基因序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，编码所述突变型p17短肽的基因序列为aagggcttcagagacgaaaaaaagaggttcaagaacacgaagggc。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括编码纳米抗体的基因序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.5或seq id no.6所示。
6.根据权利要求2所述的核酸分子，...
【专利技术属性】
技术研发人员：余乐，李嘉琪，李威，郭年华，程威，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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