【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学领域，具体涉及一种苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal及其用途。
技术介绍
1、肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸，有顺式和反式两种异构体，通常多为反式。肉桂酸具有特殊的水果香气，常被用于调配水果香型的产品，另外，肉桂酸还具有抑制形成形成黑色酪氨酸酶的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，因此几乎所有高级防晒霜中都含有肉桂酸。
2、现有技术中主要通过如heck反应、perkin反应等化学合成的方法来制备肉桂酸，但这些化学合成方法需要到昂贵的化学试剂且反应条件苛刻，其两种异构体的选择性也难以难控，因此化学合成并非制备肉桂酸的最佳方法。目前也有技术人员选择从肉桂皮或安息香等天然植物中提取肉桂酸，但天然植物中肉桂酸的含量很少，提取分离难度较大，且采用该方法成本较高不利于产业化。
3、近年来，生物合成技术因具备反应条件温和、环境友好、特异性高、制备速度快、产量高、可持续生产等优点被广泛应用于各类型化合物的生产制备中，但目前用于高效产肉桂酸的相关基因片段还未见报道。
4、本专利技术旨在解决上述问题中的至少一个。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的以在于提供一种苯丙氨酸氨裂解酶基因；目的二在于提供一种重组载体；目的三在于提供一种转化体；目的四在于提供所述苯丙氨酸氨裂解酶基因用于制备肉桂酸的用途。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：
3、一种苯丙氨酸氨裂解酶基因，所述苯丙
4、本专利技术进一步提供一种重组载体，是将上述苯丙氨酸氨裂解酶的核苷酸序列与载体连接得到。
5、本专利技术还进一步提供一种转化体，通过将上述一种重组载体转化至宿主中获得。
6、其中，将上述一种重组载体转化至宿主中的方法，具体包括以下步骤：
7、步骤(1)、敲除野生型酿酒酵母kmly1-2中的ura3基因，得到底盘菌株，命名为酿酒酵母kmly1-8；
8、步骤(2)、将酿酒酵母kmly1-8制备成感受态细胞；
9、步骤(3)、构建arpal基因过表达质粒，命名为py26tef-gpd-arpal；
10、步骤(4)、在转化体系，使用peg-醋酸锂化学转化法将重组质粒py26tef-gpd-arpal转化至kmly1-8感受态细胞中，挑取单菌落用引物py-vf(pal)、py-vr(pal)进行菌落pcr验证，验证成功的菌株即为arpal基因过表达菌株kmly1-8/py26tef-gpd-arpal。
11、进一步的，所述步骤(1)中敲除野生型酿酒酵母kmly1-2中的ura3基因的方法为：构建重组质粒p3052-ura3-sgrna，在转化体系中，使用peg-醋酸锂化学转化法将表达cas9蛋白的质粒pcfb2312、重组质粒p3052-ura3-sgrna和donor dna转化至kmly1-2菌株感受态细胞中，使用引物ura3-vf1和ura3-vr1对单菌落进行菌落pcr验证，验证成功的菌株为酿酒酵母kmly1-2 ura3基因敲除菌株，酿酒酵母kmly1-8。
12、进一步的，所述步骤(3)构建arpal基因过表达质粒的方法为：以自金线兰的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal进行密码子优化，然后在其5′和3′端分别合成上启动子padh1(如seq id no.4所示)和终止子tpdc1(如seq id no.5所示)，所得dna序列如seq id no.1所示,以所合成的dna为模版，使用引物pal-f1①、pal-r1①进行pcr扩增得到基因arpal表达框；pcr反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性15s，50.9℃退火15s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸5min后，采用通用型dna纯化回收试剂盒纯化pcr产物，获得基因arpal表达框；以质粒py26tfe-gpd为模板，使用引物py26-f1①、py26-r1①扩增得到线性化表达载体，pcr反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性15s，50.9℃退火15s，72℃延伸7min，30个循环后72℃延伸5min后，使用通用型dna纯化回收试剂盒对pcr产物进行纯化回收，获得线性化表达载体；将基因arpal表达框和线性化载体进行无缝克隆连接，并提取阳性转化子中的质粒，得到arpal基因过表达质粒。
13、所述宿主选自酿酒酵母kmly1-8，酿酒酵母kmly1-8为酿酒酵母野生型菌株kmly1-2通过敲除ura3基因获得。kmly1-2为专利技术人前期分离获得，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2018457。
14、本专利技术还提供上述苯丙氨酸氨裂解酶基因用于制备肉桂酸的用途。
15、其中，本专利技术中肉桂酸的生物合成途径为苯丙氨酸在苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine ammonia lyase，pal)的作用下脱氨降解生成肉桂酸。
16、本专利技术具有以下有益效果：
17、本专利技术通过将来源于金线兰的苯丙氨酸氨裂解酶基因arpal转化入酿酒酵母kmly1-8中，构建的基因工程菌可生产肉桂酸的含量最高可为7.45mg/l，在肉桂酸生物合成领域具有巨大应用潜力。
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1.一种苯丙氨酸氨裂解酶基因，其特征在于，所述苯丙氨酸氨裂解酶基因来源于金线兰，命名为Arpal，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组载体，是将权利要求1所述苯丙氨酸氨裂解酶的核苷酸序列与载体连接得到。
3.一种转化体，通过将权利要求2所述一种重组载体转化至宿主中获得。
4.根据权利要求3所述的一种转化体，其特征在于，所述宿主选自酿酒酵母KMLY1-8，酿酒酵母KMLY1-8为通过敲除酿酒酵母野生型菌株KMLY1-2的ura3基因获得。
5.一种权利要求1所述苯丙氨酸氨裂解酶基因用于制备肉桂酸的用途。
【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸氨裂解酶基因，其特征在于，所述苯丙氨酸氨裂解酶基因来源于金线兰，命名为arpal，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种重组载体，是将权利要求1所述苯丙氨酸氨裂解酶的核苷酸序列与载体连接得到。
3.一种转化体，通过将权利要求2所述一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：巩效伟，朱东来，罗义勇，秦云华，赵杨，麻广慧，李世卫，吴恒，洪鎏，郑聪悦，郭英，李志强，于法月，郭苗苗，向能军，赵伟，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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