【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽，具体为一种具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法。
技术介绍
1、多肽是一类由氨基酸残基通过肽键连接而成的生物分子，也是蛋白质水解的中间产物，分为生物活性多肽和人工合成多肽。多肽在药物研发、临床治疗、食品、美容护肤等领域应用广泛，随着多肽合成技术的发展和多肽需求量的增加，对多肽的抗菌、抗氧化功能的要求也越来越高，如专利cn110981953b公布了一种多肽和多肽的应用及包含多肽的组合物，具有良好的抗凝血活性，但其抗菌、抗氧化功能还有待改善。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，该方法制备的多肽具有较好的抗菌、抗氧化功能。
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，所述具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，包括以下步骤：
5、(1)向去离子水中加入12-16重量份的洗净切碎的金枪鱼骨样品，搅拌均匀，加入6-9重量份的碱性蛋白酶，调节ph为9-11，在35-45℃下进行酶解，酶解结束后，在95-100℃下进行灭酶，得到金枪鱼骨酶解液；
6、(2)向10-12重量份的金枪鱼骨酶解液中加入无水乙醇，搅拌均匀后静置沉淀8-14h，抽滤并旋蒸，然后利用切向流超滤系统进行分离，收集滤液并冻干，得到一种多肽，采用lc-ms对多肽的氨基酸序列进行分析鉴定，结果搜索鱼类胶原蛋白库进
7、(3)向四氢呋喃溶剂中加入n-(环氧丙基)-n-苯基-环氧乙烷甲胺、3-溴丙烯，搅拌混合，在82-90℃下回流加热3-4h，反应结束后，冷却、洗涤并干燥，得到中间体1；
8、(4)向去离子水中加入11-13重量份的中间体1，搅拌溶解，5-7重量份的壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，将中间体1的水溶液缓慢滴加至壳聚糖溶液中，在65-75℃下回流加热7-9h，反应结束后，洗涤，冷冻干燥，得到含烯基季铵化壳聚糖；
9、(5)向四氢呋喃溶剂中加入含烯基季铵化壳聚糖，搅拌溶解，向其中加入半胱氨酸、对甲苯磺酸催化剂，在60-80℃下反应2-3h，反应结束后，过滤、洗涤并干燥，得到中间体2；
10、(6)向n,n–二甲基甲酰胺溶剂中加入7-10重量份的中间体2、13-15重量份的4-乙烯基咪唑、0.3-0.6重量份的安息香二甲醚光引发剂，在28-32℃下用365nm的紫外光照射，结束后离心分离，洗涤并干燥，得到含烯基咪唑改性半胱氨酸；
11、(7)向n,n–二甲基甲酰胺溶剂中加入序列为akgqrgppgkr的多肽，搅拌溶解，加入含烯基咪唑改性半胱氨酸、n,n-二异丙基乙胺催化剂，通入氮气保护，在20-30℃下反应2.5-4.5h，反应结束后，洗涤并干燥，得到含烯基咪唑改性半胱氨酸修饰多肽；
12、(8)向无水乙醚溶剂中加入阿魏酸和苯并三唑，搅拌溶解，冰浴冷却至-5-0℃，向其中缓慢滴加二环己基碳二亚胺的乙醚溶液，滴加完毕后，保温反应2-4h，升温至15-25℃，继续反应14-15h，反应结束后，过滤，冷却结晶，得到苯并三唑活化的阿魏酸；
13、(9)向n-甲基吡咯烷酮溶剂中加入8-12重量份的苯并三唑活化的阿魏酸，冰浴冷却至0-5℃，向其中加入9-11重量份的含烯基咪唑改性半胱氨酸修饰多肽、0.2-0.4重量份的三乙胺催化剂，保温反应2.5-3h，反应结束后，加入丙酮溶剂，在转速8000-10000rmp下冷冻离心8-10min，静置后除去上清液，将沉淀冷冻干燥，得到具有抗菌、抗氧化功能的多肽。
14、优选的，所述步骤(1)中灭酶时间为8-12min。
15、优选的，所述步骤(2)中乙醇的质量分数为70-85％。
16、优选的，所述步骤(3)中n-(环氧丙基)-n-苯基-环氧乙烷甲胺、3-溴丙烯的质量比为1:0.8-0.84。
17、优选的，所述步骤(4)中醋酸水溶液的质量分数为2-4％。
18、优选的，所述步骤(5)中含烯基季铵化壳聚糖、半胱氨酸、对甲苯磺酸的质量比为1:0.6-0.8:0.025-0.03。
19、优选的，所述步骤(6)中紫外光照射时间为2.5-3.5h。
20、优选的，所述步骤(7)中序列为akgqrgppgkr的多肽、含烯基咪唑改性半胱氨酸、n,n-二异丙基乙胺的质量比为1:0.8-1:0.05-0.07。
21、优选的，所述步骤(8)中阿魏酸、苯并三唑、二环己基碳二亚胺的质量比为1:0.85-0.9:0.06-0.08。
22、优选的，所述步骤(9)中冷冻离心的温度为-15至-10℃。
23、(三)有益的技术效果
24、本专利技术通过从金枪鱼骨中提取序列为akgqrgppgkr的多肽，将含有烯基的季铵化壳聚糖和咪唑基团接枝到半胱氨酸上，得到含烯基咪唑改性半胱氨酸，再将含烯基咪唑改性半胱氨酸和阿魏酸分别接枝到多肽的羧基端与氨基端上，得到具有抗菌、抗氧化功能的多肽。
25、n-(环氧丙基)-n-苯基-环氧乙烷甲胺中的叔胺与3-溴丙烯发生季铵化反应，并引入环氧基与烯基，得到中间体1，中间体1中的环氧基与壳聚糖中的氨基反应，得到含烯基季铵化壳聚糖，含烯基季铵化壳聚糖中的羟基与半胱氨酸中的羧基发生酯化反应，并引入巯基与氨基，得到中间体2，中间体2中的巯基与4-乙烯基咪唑发生点击反应，引入咪唑基，得到含烯基咪唑改性半胱氨酸，含烯基咪唑改性半胱氨酸中的氨基与多肽中的羧基端发生酰胺化反应形成肽键，得到含烯基咪唑改性半胱氨酸修饰多肽。阿魏酸中的羧基与苯并三唑中的三唑环发生缩合反应，活化羧基，得到苯并三唑活化的阿魏酸，再将苯并三唑活化的阿魏酸接枝到含烯基咪唑改性半胱氨酸修饰多肽中的氨基端上，得到具有抗菌、抗氧化功能的多肽。
26、季铵盐分子带有的正电荷可以与细菌细胞膜中的负电荷发生静电吸引，破坏细胞膜，使细胞内容物泄漏，导致细胞死亡，从而起到抗菌效果；烯基中的碳-氢键可以断裂，释放出氢原子，这些氢原子能够与自由基结合，形成更稳定的分子，从而提高多肽的抗氧化功能；壳聚糖作为一种多阳离子聚合物，可以与细菌的dna、rna等核酸结合，影响核酸的复制和转录过程，壳聚糖还能与细菌内部的蛋白质发生相互作用，抑制细菌蛋白质的正常合成，从而起到杀菌效果；咪唑基通过抑制酶活性，使真菌细胞膜中的麦角固醇无法合成，改变细胞膜通透性，导致胞内物质外漏而使真菌死亡；阿魏酸中的酚羟基通过将不安定电子转移到自身形成稳定结构，减少自由基的伤害，还能和生物膜的磷脂结合，通过保护膜脂质来减少自由基损害，从而起到抗氧化作用。
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1.一种具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭酶时间为8-12min。
3.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙醇的质量分数为70-85％。
4.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中N-(环氧丙基)-N-苯基-环氧乙烷甲胺、3-溴丙烯的质量比为1:0.8-0.84。
5.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中醋酸水溶液的质量分数为2-4％。
6.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中含烯基季铵化壳聚糖、半胱氨酸、对甲苯磺酸的质量比为1:0.6-0.8:0.025-0.03。
7.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中紫外光照
8.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中序列为AKGQRGPPGKR的多肽、含烯基咪唑改性半胱氨酸、N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:0.8-1:0.05-0.07。
9.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(8)中阿魏酸、苯并三唑、二环己基碳二亚胺的质量比为1:0.85-0.9:0.06-0.08。
10.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中冷冻离心的温度为-15至-10℃。
...【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭酶时间为8-12min。
3.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙醇的质量分数为70-85％。
4.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中n-(环氧丙基)-n-苯基-环氧乙烷甲胺、3-溴丙烯的质量比为1:0.8-0.84。
5.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中醋酸水溶液的质量分数为2-4％。
6.根据权利要求1所述的具有抗菌、抗氧化功能的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤(5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张珍妮，
申请(专利权)人：山东太爱肽生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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