【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开和专利技术涉及核酸检测领域。具体地，本公开和专利技术涉及用于检测滚环扩增(rca)或产生大核酸产物的其他扩增或杂交反应的产物的方法。根据本文的方法，可以改善同一反应混合物中差异化标记的rca或其他核酸扩增产物的解析。这在靶核酸序列的检测中具有特定的适用性。
技术介绍
1、靶核酸序列的检测在许多不同领域应用，包括尤其是临床上的个性化医疗和疾病(例如癌症、传染病和遗传性或基因疾病)的诊断、预后和/或治疗，以及研究和生物安全性。
2、使用标记的杂交探针可以容易地检测到靶核酸序列，但是简单的杂交探针具有相对较高的检测下限，并且不能容易地用于区分相似的核酸序列。为了增加灵敏度，通常可以扩增含有靶序列的靶核酸分子，以增加可用于检测的靶序列的量。任何本领域已知的各种技术都可用于扩增，具体而言，滚环扩增(rca)具有许多优点。
3、rca是一种等温扩增技术，其利用链置换聚合酶并需要环状扩增模板。环状模板的扩增提供了串联的rca产物，该产物包含与扩增模板互补的序列的多个拷贝。这种串联体通常会形成很容易被观察和检测到的球或"串滴(blob)"，因此，基于rca的分析已用于检测核酸，甚至普遍地用作检测任意靶分析物的报告系统。本身可以直接环化的两类靶核酸、或者探针、或者更普遍的报告核酸可以为rca提供模板核酸环。
4、上述基于rca的分析依赖于对初始rca产物的二次扩增，以增加检测的产物量，从而提供检测中的信号放大。这些包括例如超支化rca，其通过链替换活性产生许多未成簇的后续rca产物。最近，已经开发出所谓的
5、在wo 2015/071445中，描述了一种称为“挂锁srca(padlock srca)”的替代srca的方法，其中,使用挂锁探针直接与初始rca产物(rcp)结合。因此，挂锁探针可与第一rcp的每个单体重复(即用于生成第一rcp的第一rca模板的每个互补拷贝)杂交，或至少与其中的大部分杂交。然后，杂交的挂锁探针可以通过分子内连接环化，并作为第二rca模板，生成与第一rcp连接的第二rcp。
6、这种rca(特别是srca)方法所提供的灵敏度，意味着它们已应用于稀有或低丰度靶标的检测，尤其是在检测突变或可获得的样本数量有限的情况，这些突变可能是罕见事件。通常以多重形式进行该检测分析是方便或可取的，其中，一同检测同一样品或反应混合物中的多个靶核酸序列。这就要求以可以将它们彼此区分的方式在混合物中检测每个单独的靶标生成的单个rcp。
7、rcp通常带有检测标记。这可能涉及将标签掺入产物中，例如，通过在rcp合成过程中掺入标记的核苷酸，或通过使用嵌合染料来标记rcp。标记rcp的一种常见方法是使用与rcp杂交的标记的检测寡核苷酸。因此，rcp可以被直接或间接标记。rcp是长串联体，包含许多(通常是数百个，在某些情况下数千个)rca模板环的互补拷贝重复，也提供了大量的可以掺入或连接标签的位点。srca产物包含非常多的这样的串联体，因为挂锁探针可以与高比例的第一rcp的单体重复杂交(直接或间接)，并且每个这样的挂锁探针可以产生第二rcp。因此，产生的srca产物(srcp)可以会被许多标记分子标记。
8、任何依靠使用标签来区分大型核酸产物的多重检测技术的一个共同问题是不同产物中或不同产物上的标签之间可能会产生干扰。具体而言，已经发现在同一混合物中连接在单个rcp上的标签可能会相互粘连，从而阻碍单个rcp的解析。由于基于rca的检测技术的一个特殊优点是可以单独检测和定量单个rcp，因此这就存在可能会干扰分析的问题，并降低了可以进行的多重检测的水平。
9、该问题不限于rcp的检测，也适用于任何包含或提供大量标记位点的大型或高分子量核酸产物中。这可能包括例如杂交链反应(hcr)的扩增方法的产物，其中掺入大量的单体，每个单体都包含可以与检测寡核苷酸杂交的标签或可检测序列。例如，已知信号放大方法可能涉及建立相互杂交的探针序列，为标记的检测探针或其他标记系统提供多个结合位点，例如wo2011/094669中所描述的rnascopetm技术。虽然rnascopetm是为原位杂交检测rna而开发的，但它例示了使用夹心型或中间型杂交探针的原理，每种杂交探针都提供了多个用于与标记的检测探针结合的结合位点，从而生成包含多个标签的可检测核酸产物。这种核酸产物可被视为所谓的"核酸积聚"(naa)，其中包括多个用于检测的靶位点，或者换句话说，多个可检测位点。
技术实现思路
1、概述
2、本专利技术人发现，差异化标记的核酸产物(例如rcp和其他naa)的解析可以通过使用解析剂来改善，当包含解析剂与标记的核酸产物时，减少了不同产物上的标签之间的干扰。
3、这种解析剂通常是蛋白质，具体地是惰性蛋白质，例如在分析方法中通常用作阻断剂以防止或减少分析试剂的非特异性结合的蛋白质。然而，它们还可能包括非蛋白质试剂，例如去污剂或合成聚合物。虽然此类阻断剂的使用是众所周知的，但之前没有描述过它们在标记或检测分析反应产物的步骤中的应用。目前提出的方法展示了此类阻断剂的新用途。
4、因此，在第一方面，本文提供了一种用于检测混合物中的两种或更多种不同标记的高分子量核酸产物的方法，其中通过检测直接或间接地连接到每个产物的一个或多个标签来检测所述产物，所述方法包括在用于检测的混合物中包含解析剂以促进不同标记的产物的解析，其中所述解析剂用于抑制不同标签之间的相互作用。
5、具体地，不同核酸产物上的标签之间的相互作用会受到抑制。
6、具体地，标签以高拷贝数连接。
7、因此，要检测的核酸产物是高分子量核酸产物，每个产物包含多个标签。具体地，核酸产物包含多个用于掺入或连接标签的位点。标记的核酸产物携带或包含多个标签拷贝。
8、待检测的核酸产物可选地被称为核酸积聚物(naa)、积聚的核酸产物或核酸簇，而不是将它们称为“高分子量”核酸产物。具体地，待检测的核酸产物可定义为naa、积聚的核酸产物或核酸簇，它们都包含多个可将它们彼此区分开来的标签拷贝。
9、差异化不同的核酸产物，使得它们可以相互区分或鉴别。在一个实施方案中，每个要检测的核酸产物都可以用一种标签(从一种标签种类的意义上来说)标记，不同的产物有不同的标签。不过，为了提高复用能力，并使混合物中更多数量的不同产物能够相互区分，可以将不同的组合和/或比例两个或多个标签(从标签种类的意义上来说)用于各产物，这样每个产物都有不同组合和/或不同比例的标签。
10、在一个本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测混合物中两种或更多种不同标记的高分子量核酸产物的方法，其中，通过检测直接或间接连接在各产物上的一种或多种标签来检测产物，所述方法包括向检测混合物中加入解析剂以促进不同标记的产物的解析，其中所述解析剂的作用是抑制不同标签之间的相互作用。
2.一种在样品的一种或多种核酸分子中检测两种或多种靶核酸序列的方法，所述方法包括：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述解析剂为或包含蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，蛋白质为惰性蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，解析剂选自脱脂奶粉或乳蛋白、血清或血清蛋白、明胶、SSB或随机序列的肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，解析剂为酪蛋白、血清白蛋白或球蛋白，任选地为免疫球蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，解析剂为猪血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或bulkIgG。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，解析剂不为或不包含蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，解析剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和Tween-20。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，高分子量核酸产物为核酸扩增产物、核酸聚合物或核酸杂交产物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，核酸产物为RCA产物或HCR产物，或分支DNA扩增反应的产物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，标签为分光光度法可检测的标签。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，标签为荧光标签、有色标签或比色标签。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，通过与标记的检测寡核苷酸杂交来标记核酸产物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，解析剂包含于或存在于产生核酸产物的一个或多个步骤中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，核酸产物为sRCA产物，并且用于sRCA反应的第一RCA的反应混合物中包含过量的解析剂，并且保留在反应混合物中用于后续步骤。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，解析剂包含于标记混合物中，所述标记混合物包含标记的检测寡核苷酸的混合物。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，解析剂包含于标记混合物中，所述标记混合物与核酸产物的混合物接触以标记核酸产物，或者解析剂在标记混合物之前、同时或之后，但在检测标记的核酸产物之前加入到核酸产物之中。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，核酸产物为使用靶特异性挂锁探针产生的超级RCA产物，挂锁探针与第一RCA产物杂交，第一RCA产物包含靶核酸序列或其互补拷贝的多个重复，其中与多个重复杂交的挂锁探针通过连接环化，用于RCA以产生第二RCA产物。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种检测混合物中两种或更多种不同标记的高分子量核酸产物的方法，其中，通过检测直接或间接连接在各产物上的一种或多种标签来检测产物，所述方法包括向检测混合物中加入解析剂以促进不同标记的产物的解析，其中所述解析剂的作用是抑制不同标签之间的相互作用。
2.一种在样品的一种或多种核酸分子中检测两种或多种靶核酸序列的方法，所述方法包括：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述解析剂为或包含蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，蛋白质为惰性蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，解析剂选自脱脂奶粉或乳蛋白、血清或血清蛋白、明胶、ssb或随机序列的肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，解析剂为酪蛋白、血清白蛋白或球蛋白，任选地为免疫球蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，解析剂为猪血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或bulkigg。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，解析剂不为或不包含蛋白质。
9.根据权利要求1、2或8中任一项所述的方法，其中，解析剂为去污剂或非氨基酸聚合物，任选地为聚乙烯醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，解析剂选自聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和tween-20。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，高分子量核酸产物为核酸扩增产物、核酸聚合物或核酸杂交产物。
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