【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及经过修饰以表达至少一种治疗分子的细胞，该治疗分子治疗或改善与特定疾病(例如阿尔茨海默病)相关的病理和/或症状。本专利技术还涉及包含上述细胞的组合物和试剂盒及其使用其治疗阿尔茨海默病的方法。
技术介绍
1、几种常见的神经退行性疾病的特征是不可溶蛋白聚集体的逐渐积累，神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症(als)。在阿尔茨海默病中，β淀粉样蛋白(aβ)采用不同的构象状态，包括不溶性纤维状aβ斑块和可溶性aβ寡聚物，这可以驱动其他下游病理的发展，包括神经原纤维缠结和神经胶质增生。这些病理共同导致神经元和突触的损失以及脑萎缩，从而造成记忆丧失、认知障碍、行为改变和痴呆。目前，美国约有600万65岁以上的人患有阿尔茨海默病。阿尔茨海默病主要是一种晚年疾病。因此，随着人口老龄化，这种疾病的发病率预计会增加。因此，必须开发新的治疗方法来满足这一日益增长的需求。然而，开发治疗脑部疾病药物的一个挑战是血脑屏障(bbb)，它对药物的递送造成了重大障碍，从而影响了药物的疗效。小分子和大分子都已被研究作为治疗脑部疾病的有效治疗剂。然而，由于分子穿过血脑屏障的物理限制，大多数大分子无法穿透脑内皮。因此，尽管数十年来一直致力于开发安全有效的脑部疾病治疗方法，但通过血脑屏障递送足够浓度的药物以达到目标作用仍然是一个根本障碍。
2、近年来，car-t细胞疗法已证明了利用工程细胞来将治疗剂直接且有选择地递送到癌症病理部位的能力。对于中枢神经系统疾病，神经和骨髓干细胞已被探索作为递送治疗药物的载体。不幸的是
3、小胶质细胞是大脑的主要先天免疫细胞，在维持神经元稳态和探测局部环境中的致病因子和神经元损伤方面发挥着关键作用。最近，开发了一种嵌合小鼠模型，可以检查人类ipsc衍生的小胶质细胞与神经病理学之间的相互作用。在该模型中，异种移植后，人类ipsc衍生的小胶质细胞(xmg)广泛分散，成熟为稳态小胶质细胞，表现出类似于体内的转录谱并茁壮成长。本公开描述了如何修饰此类细胞以治疗阿尔茨海默病和其他aβ相关的神经退行性疾病。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供用于治疗或预防与β淀粉样蛋白相关病理有关的疾病或病症(包括但不限于阿尔茨海默病(ad))或改善或延缓与β淀粉样蛋白相关病理有关的症状和/或病理过程的组合物和方法。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白相关病理与阿尔茨海默病有关。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白相关病理与帕金森病有关。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白相关病理与亨廷顿氏病有关。在一些实施方案中，β淀粉样蛋白相关病理与肌萎缩侧索硬化症(als)有关。本专利技术不限于前述与β淀粉样蛋白病理相关的疾病或病症。
2、本专利技术的实施方案在不互相排斥的情况下可以自由地相互组合。
3、尽管先前曾使用rag2和il2受体γ(il2rγ)基因缺失的免疫缺陷小鼠来移植人类细胞，但最初使用标准免疫缺陷小鼠生成人类小胶质细胞嵌合小鼠的尝试失败了。经过多次杂交和实验，令人惊讶地发现，携带人源化csf-1等位基因的小鼠模型对于人类异种移植小胶质细胞的长期植入和存活是必要的(hasselmann等人，neuron,2019；补充图s2)。不仅该模型的生成是一个挑战，而且还存在其他困难，包括将模型回交到淀粉样蛋白产生系(5×fad小鼠)上，以及恢复rag2，il2rγ人源化csf-1等位基因的纯合性。
4、研究表明小鼠小胶质细胞对分离程序高度敏感(marsh等人，nat neurosci，2022)。尽管面临挑战，专利技术人还是开发出了一种快速纯化植入人类小胶质细胞的方法，对植入人类小胶质细胞的破坏最小。这是通过采用负磁分选方法消除所有小鼠细胞，只留下未被触及但高纯度且具有活力的人类小胶质细胞来实现的。hasselmann等人在neuron(2019)中提供了该新型分离方法的详细信息和验证。这种分离方法可以从嵌合小鼠的大脑中分离出人类小胶质细胞，以检查基因表达并识别出响应β淀粉样蛋白病理而表现出表达变化的候选小胶质细胞基因。
5、上述分离方法实现了单细胞测序，提供了斑块反应性小胶质细胞基因的部分列表。然而，单细胞测序的灵敏度低于批量rna测序，并且通常只能捕获最丰富表达的转录本。尽管面临挑战，专利技术人仍然能够开发出一种方法，从同一嵌合小鼠大脑中分离出对斑块有反应的小胶质细胞和对斑块无反应的小胶质细胞，从而更好地了解人类小胶质细胞对斑块的反应。单细胞测序数据和随后的免疫组织化学验证(参见图1a-1p)表明，cd9和hla-drb在斑块相关人类小胶质细胞中高度富集。专利技术人还开发了一种荧光激活细胞分类(facs)方法来分离cd9/hla-drb双阳性小胶质细胞与双阴性稳态小胶质细胞。这是通过向小鼠移植四个独立的人类小胶质细胞样本然后进行批量rna测序实现的。该分析提供了如本文所述的斑块诱导的人类小胶质细胞基因的更完整的数据集(参见图20a-20d)。
6、本公开的一个方面提供了一种修饰细胞，用于治疗β淀粉样蛋白相关病理(例如，阿尔茨海默病(ad)、帕金森病、亨廷顿病、als、其他神经退行性疾病，例如，其他与aβ相关的神经退行性疾病)或改善与所述β淀粉样蛋白相关病理有关的症状和/或病理过程。该细胞对β淀粉样蛋白(aβ)相关病理敏感。例如，在一些实施方案中，当修饰细胞接近或接触aβ相关病理(本文中也可称为阿尔茨海默病相关病理)，例如β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、包含不同长度的aβ的纤维或其组合时，修饰细胞表达、呈递、分泌治疗分子或其组合。在一些实施方案中，当修饰细胞接近或接触β淀粉样蛋白相关病理(例如，阿尔茨海默病相关病理)时，修饰细胞表达并分泌治疗分子。在一些实施方案中，当修饰细胞接近或接触β淀粉样蛋白相关病理时，修饰细胞表达、呈递并分泌治疗分子。治疗分子改变一种或多种β淀粉样蛋白相关病理表型或β淀粉样蛋白相关病理的至少一个方面。例如，在一些实施方案中，治疗分子减少aβ聚集体的大小和/或数量。本专利技术不限于前述改变β淀粉样蛋白相关病理表型的实例。
7、β淀粉样蛋白相关病理表型或症状可能包括记忆问题、学习障碍、认知问题、视力问题、行为改变、人格改变、抑郁或癫痫发作中的一种或多种组合。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括可溶性aβ单体。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括不溶性aβ单体。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括aβ寡聚体。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括原纤维。在一些实施方案中，aβ相关病理可能包括含有不同长度的aβ的原纤维。在一些实施方案中，aβ相关病理可以包括以下之一或其组合：β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人类诱导小胶质细胞样(iMGL)细胞，其表达并呈递包含膜结合型脑啡肽酶的治疗分子或表达并分泌包含分泌型脑啡肽酶的治疗分子。
2.人类诱导小胶质细胞样(iMGL)细胞，其表达并呈递或表达并分泌治疗分子，所述治疗分子包含：膜结合型脑啡肽酶、分泌型脑啡肽酶、TREM2、APOE、LRP1、胰岛素降解酶、内皮素转换酶、纤溶酶原激活剂、血管紧张素转换酶或基质金属蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中启动子被配置为在(i)所述细胞接近β淀粉样蛋白(Aβ)肽斑块、可溶性Aβ单体、不溶性Aβ单体、Aβ寡聚体、焦谷氨酸Aβ、原纤维、或包含Aβ或其片段的纤维时；或(ii)所述细胞与β淀粉样蛋白(Aβ)肽斑块、可溶性Aβ单体、不溶性Aβ单体、Aβ寡聚体、焦谷氨酸Aβ、原纤维、或包含Aβ或其片段的纤维接触时激活所述治疗分子的转录。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述细胞表达P2RY12和TREM2。
5.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞包含编码所述治疗分子的核酸序列；以及启动子，所述启动子选自CD9基因启动子、LGALS3基因启
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含CD9基因启动子。
7.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含LGALS3基因启动子。
8.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含HLA-DRB基因启动子。
9.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含CD11c基因启动子。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含膜结合型脑啡肽酶或分泌型脑啡肽酶。
11.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种。
12.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含TREM2。
13.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含胰岛素降解酶。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞，其中所述核酸序列插入到所述细胞的基因组中。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述核酸序列插入受启动子控制的基因座的下游，使得所述核酸序列与所述基因座外显子中的编码序列符合读框。
16.根据权利要求14所述的细胞，其中所述核酸序列插入受启动子控制的基因座内，使得所述核酸序列与所述基因座的至少部分编码序列符合读框连接。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的细胞，其中编码蛋白酶剪切位点、核糖体跳跃序列或自剪切肽的第一多核苷酸插入外显子的编码序列与编码治疗性蛋白的核酸序列之间。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述自剪切肽是P2A。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中编码分泌肽信号序列的第二多核苷酸插入到编码治疗性蛋白的核酸序列的5'端。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞，其中所述治疗性蛋白影响一种或多种β淀粉样蛋白(Aβ)相关病理。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中Aβ相关病理包含β淀粉样蛋白(Aβ)肽斑块、可溶性Aβ单体、不溶性Aβ单体、Aβ寡聚体、焦谷氨酸Aβ、原纤维、或包含不同长度的Aβ的纤维。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子减少个体的脑中Aβ肽斑块中的Aβ肽的量。
23.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子减小可溶性Aβ单体、不溶性Aβ单体、Aβ寡聚体、焦谷氨酸Aβ、原纤维或包含不同长度的Aβ的纤维的尺寸或数量。
24.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子增强淀粉样蛋白水解。
25.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子增强小胶质细胞对β淀粉样蛋白的吞噬作用。
26.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(Aβ)相关病理时，所述修饰细胞表达并呈现或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除Aβ相关病理表型或改善Aβ相关病理症状。
27.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(Aβ)相关病理时，所述修饰细胞表达并呈递或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除Aβ相关病理的至少一个方面。
28.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(Aβ)聚集体时，所述修饰细胞表达并呈递或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.人类诱导小胶质细胞样(imgl)细胞，其表达并呈递包含膜结合型脑啡肽酶的治疗分子或表达并分泌包含分泌型脑啡肽酶的治疗分子。
2.人类诱导小胶质细胞样(imgl)细胞，其表达并呈递或表达并分泌治疗分子，所述治疗分子包含：膜结合型脑啡肽酶、分泌型脑啡肽酶、trem2、apoe、lrp1、胰岛素降解酶、内皮素转换酶、纤溶酶原激活剂、血管紧张素转换酶或基质金属蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中启动子被配置为在(i)所述细胞接近β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、或包含aβ或其片段的纤维时；或(ii)所述细胞与β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、或包含aβ或其片段的纤维接触时激活所述治疗分子的转录。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述细胞表达p2ry12和trem2。
5.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞包含编码所述治疗分子的核酸序列；以及启动子，所述启动子选自cd9基因启动子、lgals3基因启动子、hla-drb基因启动子或cd11c基因启动子，其中所述启动子可操作地连接至编码所述治疗分子的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含cd9基因启动子。
7.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含lgals3基因启动子。
8.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含hla-drb基因启动子。
9.根据权利要求5所述的细胞，其中所述启动子包含cd11c基因启动子。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含膜结合型脑啡肽酶或分泌型脑啡肽酶。
11.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含seq id no:1、seqid no:2或seq id no:3中的一种。
12.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含trem2。
13.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子包含胰岛素降解酶。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞，其中所述核酸序列插入到所述细胞的基因组中。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述核酸序列插入受启动子控制的基因座的下游，使得所述核酸序列与所述基因座外显子中的编码序列符合读框。
16.根据权利要求14所述的细胞，其中所述核酸序列插入受启动子控制的基因座内，使得所述核酸序列与所述基因座的至少部分编码序列符合读框连接。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的细胞，其中编码蛋白酶剪切位点、核糖体跳跃序列或自剪切肽的第一多核苷酸插入外显子的编码序列与编码治疗性蛋白的核酸序列之间。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述自剪切肽是p2a。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中编码分泌肽信号序列的第二多核苷酸插入到编码治疗性蛋白的核酸序列的5'端。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞，其中所述治疗性蛋白影响一种或多种β淀粉样蛋白(aβ)相关病理。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中aβ相关病理包含β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、或包含不同长度的aβ的纤维。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子减少个体的脑中aβ肽斑块中的aβ肽的量。
23.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子减小可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维或包含不同长度的aβ的纤维的尺寸或数量。
24.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子增强淀粉样蛋白水解。
25.根据权利要求20-21中任一项所述的细胞，其中所述治疗分子增强小胶质细胞对β淀粉样蛋白的吞噬作用。
26.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(aβ)相关病理时，所述修饰细胞表达并呈现或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除aβ相关病理表型或改善aβ相关病理症状。
27.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(aβ)相关病理时，所述修饰细胞表达并呈递或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除aβ相关病理的至少一个方面。
28.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(aβ)聚集体时，所述修饰细胞表达并呈递或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除β淀粉样蛋白相关病理或改善其症状。
29.修饰细胞，当细胞接近或接触β淀粉样蛋白(aβ)聚集体、斑块、寡聚体或原纤维时，所述修饰细胞表达并呈递或分泌治疗分子，其中所述治疗分子减少或消除β淀粉样蛋白相关病理或改善其症状。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的细胞，其中所述β淀粉样蛋白相关病理表型包含选自记忆问题、认知问题、视力问题、行为改变、人格改变、抑郁和癫痫的表型。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含编码所述治疗分子的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至对β淀粉样蛋白相关病理有反应的启动子。
32.表达并呈递或分泌治疗分子的修饰细胞，所述修饰细胞包含：
33.表达并呈递或分泌治疗分子的修饰细胞，所述修饰细胞包含：
34.修饰细胞，其表达并呈递或分泌包含膜结合型脑啡肽酶或分泌型脑啡肽酶的治疗分子，所述修饰细胞包含：
35.修饰细胞，其表达并呈递或分泌包含膜结合型脑啡肽酶、分泌型脑啡肽酶、trem2或胰岛素降解酶的治疗分子，所述修饰细胞包含：
36.小胶质细胞样(mgl)细胞，其表达并呈递或分泌治疗分子，所述治疗分子剪切β淀粉样蛋白、结合β淀粉样蛋白、增强淀粉样蛋白水解、增强小胶质细胞对β淀粉样蛋白的吞噬作用、或它们的组合；所述细胞包含：
37.根据权利要求31-36中任一项所述的细胞，其中所述启动子被配置为在(i)所述细胞接近β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、或包含aβ或其片段的纤维时；或(ii)所述细胞与β淀粉样蛋白(aβ)肽斑块、可溶性aβ单体、不溶性aβ单体、aβ寡聚体、焦谷氨酸aβ、原纤维、或包含aβ或其片段的纤维接触时激活所述治疗分子的转录。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述细胞表达p2ry12和trem2。
39.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是迁移细胞或由可分化成迁移细胞的细胞谱系产生。
40.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是多能干细胞(psc)、诱导多能干细胞(ipsc)、髓系祖细胞、红系髓系祖细胞、造血干细胞、造血祖细胞、淋巴祖细胞、巨核细胞-红细胞(mk-ery)、脐带血干细胞或胚胎干细胞。
41.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是单核细胞。
42.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是骨髓来源的造血前体细胞。
43.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是神经干细胞。
44.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是ipsc衍生的小胶质细胞。
45.根据权利要求31-35中任一项所述的细胞，其中所述细胞是ipsc衍生的造血前体细胞。
...【专利技术属性】
技术研发人员：马修·布卢顿琼斯，让·保罗·查达里维扬，罗伯特·斯皮塔勒，苏尼尔·甘地，海克·达夫蒂扬，乔纳森·哈塞尔曼，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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