【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及一种新型硫醇还原剂及其制备方法和用途。该硫醇还原剂可用于抗体修饰。
技术介绍
1、本节中的陈述仅提供与本专利技术相关的背景信息，并不一定构成现有技术。
2、抗体药物偶联物(adc)是一种创新型生物制药产品，通过合适的连接子将单克隆抗体与小分子药物连接，将强效的细胞毒性药物递送至表达抗原的细胞，adc理想地结合了抗体的特异性和细胞毒性药物的高效力，从而增强其靶向细胞毒性活性。
3、一般而言，抗体与细胞毒性试剂的偶联通常包括直接与治疗性igg(免疫球蛋白g)抗体上的裸露残基(包括赖氨酸)偶联，或者还原链间二硫键以暴露半胱氨酸残基偶联。除此之外还有其他新发展起来的方法将偶联位点引入到mab，例如位点特异性聚糖偶联、半胱氨酸工程改造、引入非天然氨基酸以及在药物-连接子上增加短肽标签。抗体上通常存在80个赖氨酸残基；然而，可以通过化学方式进行偶联的残基不到10个。半胱氨酸偶联最多可以实现四个链间二硫键的还原。这些键在特定条件下被还原，随后产生两个、四个、六个或八个暴露的巯基。cys偶联方法和lys偶联方法两者都会产生异质混合物。(“advances andlimitations of antibody drug conjugates for cancer”(用于癌症的抗体药物偶联物的进展和局限性)《生物医药》(biomedicines)。2021年8月；9(8):872.)。
4、药物抗体比(dar)或与单个抗体偶联的药物分子的数目对于决定adc的药效非常重要。dar值变化范围很大而且取决于其
5、目前已经开发出许多种方法来提高adc的均一性。例如，genentech的thiomab技术就是基于通过抗体工程提高adc的均一性而开发的，通过在抗体的一级序列中引入半胱氨酸，实现位点特异性偶联来提高产品的均一性(“cysteine-based coupling:challengesand solutions”(基于半胱氨酸的耦合：挑战与解决方案)。《生物共轭化学》(bioconjugchem.)。2021年8月18日；32(8):1525-1534.)。
6、us20210040145公开了一种由14个氨基酸组成的短肽tub-tag，可应用于任何poi的c末端，并能催化各种不同酪氨酸衍生物的加成。tub-tag技术利用微管蛋白酪氨酸连接酶将功能化的组分连接抗体的c末端，从而均一地生成dar2型抗体偶联物。
7、然而，这些技术都需要蛋白质工程和/或酶催化，因此这些技术存在一些缺点，诸如抗体表达水平较低、免疫原性风险、纯化过程复杂和/或成本较高。
8、在均一性得到提升后，抗体药物偶联物可以获得更好的稳定性和更低的免疫原性等益处，并在治疗中进一步带来获益，例如更好的疗效和更低的毒性。因此，开发新型还原剂以及高均一性adc的制备工艺是迫切需求，也是长期目标。
技术实现思路
1、为了上述目的，本文提供了一种具有下式(i)的还原剂：
2、
3、或其盐、溶剂化物、立体异构体，其特征在于，
4、r1为h、-nh2、-c(o)(r3r4)、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c1-c5羟烷基、或任选取代的芳基；
5、r3为n、nh或o；
6、r4为h、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c1-c5羟烷基、或任选取代的芳基；
7、r2为h、任选取代的c1-c5烷基、或任选取代的c1-c5羟烷基；
8、x为oh、任选取代的c1-c5烷氧基或-nr5r6，
9、r5和r6各自独立地为h、c0-c5羟烷基、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c2-c8羧基烷基、任选取代的c1-c5烷氧基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳基烷氧基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳基、c1-c5烷基磺酰基、或-(ch2)n1(och2ch2o)n2ch(r8)co(r7)，
10、r7为c0-c5羟烷基、-nhoh，
11、r8为h、任选取代的芳烷基，
12、n1和n2各自独立地为数字0、1、2、3、4，
13、y与x相同，或y为x的酯或酰胺，
14、z与x或y相同，或
15、y和z各自独立地选自：
16、
17、x、y和z不同时为
18、在一个方面中，本文提供了一种组合物，其包含上述还原剂和过渡金属离子。过渡金属离子为zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+或其组合。
19、在一个方面中，本文提供了一种制备上述还原剂的方法，其特征在于，通过在惰性气氛下引入缩合试剂，将至少一个x’连接到式ii的化合物上，
20、
21、r1为h、-nh2、-c(o)(r3r4)、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c1-c5羟烷基、或任选取代的芳基；
22、r3为n、nh或o；
23、r4为h、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c1-c5羟烷基、或任选取代的芳基；
24、r2为h、任选取代的c1-c5烷基、或任选取代的c1-c5羟烷基；
25、x’为任选取代的c1-c5烷基醇或nr5r6，
26、r5和r6各自独立地为h、c0-c5羟烷基、任选取代的c1-c5烷基、任选取代的c2-c8羧基烷基、任选取代的c1-c5烷氧基、任选取代的杂芳烷基、任选取代的芳基烷氧基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳基、c1-c5烷基磺酰基、或-(ch2)n1(och2ch2o)n2ch(r8)co(r7)，
27、r7为c0-c5羟烷基、-nhoh，
28、r8为h、任选取代的芳烷基，
29、n1和n2独立地为数字0、1、2、3、4，
30、y与x相同，或y为x的酯或酰胺，
31、z与x或y相同，或
32、y和z各自独立地选自：
33、
34、在一个方面中，本文提供了上述还原剂或上述组合物在抗体链间二硫键的还原方面的用途。
35、在一个方面中，本文提供了一种具有位点特异性修饰的抗体的制备方法，包括以下步骤：
36、(a1)在缓冲体系中，将上述还原剂(作为第一还原剂)和过渡金属离子与抗体共孵育，以选择性地还原抗体内的链间二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有下式(I)的还原剂：
2.如权利要求1所述的还原剂，其特征在于，
3.如权利要求1所述的还原剂，其特征在于，
4.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
5.如权利要求4所述的还原剂，其特征在于，
6.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
7.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
8.如权利要求7所述的还原剂，其特征在于，
9.如权利要求7所述的还原剂，其特征在于，
10.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
11.如权利要求10所述的还原剂，其特征在于，
12.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
13.如权利要求1-12中任一项所述的还原剂，其特征在于，所述还原剂选自：
14.一种组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的还原剂和过渡金属离子。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述过渡金属离子为Zn2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+或其组合；视情
16.如权利要求14或15所述的组合物，其特征在于，所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比为0.05:1至40:1；视情况，所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比可为0.25:1至30:1；视情况；所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比进一步可为0.25:1至15:1。
17.一种方法，用于制备权利要求1-13中任一项所述的还原剂，其特征在于，通过在惰性气氛下引入缩合试剂，将至少一个X’与式II的化合物连接，
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述式II的化合物为
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述X’为2-苯氧基-乙胺、苯胺、苄胺、4-氨基苯-1,2-二醇、5-氨基-2-羟基苯甲酸、双(吡啶-2-基甲基)胺、5-氨基-8-羟基喹啉、双(吡啶-2-基)甲胺、4-氨基邻苯二甲酸、L-酪氨酸叔丁酯、DL-3-(4-氟苯基)丙氨酸、DL-4-氰基苯丙氨酸、DL-4-硝基苯丙氨酸、N-苄羟胺盐酸盐、N-苯基羟胺、
20.如权利要求1-13中任一项所述的还原剂或权利要求14-16中任一项所述的组合物在还原抗体的链间二硫键方面的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，在制备具有位点特异性修饰的抗体方面，视情况，所述具有位点特异性修饰的抗体可为抗体药物偶联物(ADC)；视情况，所述ADC进一步可为具有D2的ADC、具有D4的ADC、具有D1的ADC、具有D6的ADC、具有D3的ADC、具有D1+D6的ADC、具有D1+D2的ADC、具有D1+D4的ADC、具有D2+D4的ADC、具有D6+D2的ADC、具有D6+D1的ADC、具有D3+D1的ADC、具有D3+D2的ADC、具有D0+D6的ADC、或具有D0+D2的ADC。
22.一种方法，用于制备具有位点特异性修饰的抗体，包括以下步骤：
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述抗体的Fab区中的两个链间二硫键和所述抗体的铰链区中的一个链间二硫键被还原。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
26.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-桥接试剂和所述第二硫代-桥接试剂独立地含有至少两个取代基团，以便对硫醇基团进行再桥接。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-桥接试剂和所述第二硫代-桥接试剂各自独立地选自：
30.如权利要求22、25和27中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(A1)、(A3)和(B2)中的所述还原剂与所述抗体的摩尔比各自独立地为1:1至20、1:1至5:1、1:1至3:1、1:1至2:1或3:1至5:1。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，步骤(A1)中的所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为2.8:1至13:1，视情况，所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为3.5:1至5:1、4:1至10:1或5:1至13:1。
32.如权利要求22、25和27中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(A1)、(A3)和(B2)中的所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种具有下式(i)的还原剂：
2.如权利要求1所述的还原剂，其特征在于，
3.如权利要求1所述的还原剂，其特征在于，
4.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
5.如权利要求4所述的还原剂，其特征在于，
6.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
7.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
8.如权利要求7所述的还原剂，其特征在于，
9.如权利要求7所述的还原剂，其特征在于，
10.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
11.如权利要求10所述的还原剂，其特征在于，
12.如权利要求1或2所述的还原剂，其特征在于，
13.如权利要求1-12中任一项所述的还原剂，其特征在于，所述还原剂选自：
14.一种组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的还原剂和过渡金属离子。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述过渡金属离子为zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+或其组合；视情况，所述过渡金属离子为zn2+。
16.如权利要求14或15所述的组合物，其特征在于，所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比为0.05:1至40:1；视情况，所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比可为0.25:1至30:1；视情况；所述过渡金属离子和所述第一还原剂的摩尔比进一步可为0.25:1至15:1。
17.一种方法，用于制备权利要求1-13中任一项所述的还原剂，其特征在于，通过在惰性气氛下引入缩合试剂，将至少一个x’与式ii的化合物连接，
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述式ii的化合物为
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述x’为2-苯氧基-乙胺、苯胺、苄胺、4-氨基苯-1,2-二醇、5-氨基-2-羟基苯甲酸、双(吡啶-2-基甲基)胺、5-氨基-8-羟基喹啉、双(吡啶-2-基)甲胺、4-氨基邻苯二甲酸、l-酪氨酸叔丁酯、dl-3-(4-氟苯基)丙氨酸、dl-4-氰基苯丙氨酸、dl-4-硝基苯丙氨酸、n-苄羟胺盐酸盐、n-苯基羟胺、
20.如权利要求1-13中任一项所述的还原剂或权利要求14-16中任一项所述的组合物在还原抗体的链间二硫键方面的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，在制备具有位点特异性修饰的抗体方面，视情况，所述具有位点特异性修饰的抗体可为抗体药物偶联物(adc)；视情况，所述adc进一步可为具有d2的adc、具有d4的adc、具有d1的adc、具有d6的adc、具有d3的adc、具有d1+d6的adc、具有d1+d2的adc、具有d1+d4的adc、具有d2+d4的adc、具有d6+d2的adc、具有d6+d1的adc、具有d3+d1的adc、具有d3+d2的adc、具有d0+d6的adc、或具有d0+d2的adc。
22.一种方法，用于制备具有位点特异性修饰的抗体，包括以下步骤：
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述抗体的fab区中的两个链间二硫键和所述抗体的铰链区中的一个链间二硫键被还原。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
26.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-桥接试剂和所述第二硫代-桥接试剂独立地含有至少两个取代基团，以便对硫醇基团进行再桥接。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-桥接试剂和所述第二硫代-桥接试剂各自独立地选自：
30.如权利要求22、25和27中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a1)、(a3)和(b2)中的所述还原剂与所述抗体的摩尔比各自独立地为1:1至20、1:1至5:1、1:1至3:1、1:1至2:1或3:1至5:1。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，步骤(a1)中的所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为2.8:1至13:1，视情况，所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为3.5:1至5:1、4:1至10:1或5:1至13:1。
32.如权利要求22、25和27中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a1)、(a3)和(b2)中的所述孵育温度各自独立地为0℃至37℃、0℃至25℃、0℃至15℃、0℃至10℃、或0℃至5℃。
33.如权利要求22、25和27中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a1)中的所述孵育时间为2小时至24小时、14小时至24小时、16小时至20小时、或16小时至18小时；
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为4:1至10:1，所述孵育时间为1小时至16小时。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为6:1至13:1，所述孵育时间为4小时至16小时。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，在步骤(a1)中，所述第一还原剂与所述抗体的摩尔比为2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽丽，吉傲，贺文旭，王义成，石钰，冉亚军，
申请(专利权)人：苏州佰睿壹生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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