【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寡核苷酸合成领域，具体而言，涉及一种核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用。
技术介绍
1、寡核苷酸是生物医学和生命科学研究中调节基因表达的基本工具，作为基因靶向治疗药物，用于治疗遗传病、病毒、肿瘤等多种疾病。寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸、微小核糖核酸、核酸适配体等。天然的寡核苷酸在体内很容易被降解，成药性低，因此，药物寡核苷酸通常带有特定的修饰基团，如硫代磷酸二酯键、氟代、甲基以及锁核酸等，以增强寡核苷酸在体内的稳定性，提高特异性，并降低其毒副作用。
2、寡核苷酸主要采用的合成方式是亚磷酰胺法，但存在初产物纯度低，化学溶剂用量大，大规模放大较难等缺点，因此新兴的酶法合成寡核苷酸的方式因其绿色的合成工艺、较高的偶联效率、易于放大等众多优势而备受关注。
3、携带可逆阻断基团的核苷酸类似物是酶法合成寡核苷酸的关键原材料，利用可逆的封端基团实现寡核苷酸的特异性合成，防止错误序列的引入，同时在合成完成后可以无痕去除阻断基团以实现目标寡核苷酸的合成。
4、但是现有技术中寡核苷酸的可逆阻断基团种类较少，而且活性相对较低，导致与寡核苷酸链的偶联效率低下，使得目标寡核苷酸的合成受阻。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用，以解决现有技术中的寡核苷酸的可逆封端活性低的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种核苷单体类似物，该核苷单体类似
3、式i；
4、其中，r为碱基；r1包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；
5、r2包括羟基、单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种；r3包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种。
6、进一步地，碱基包括天然碱基或非天然碱基；天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、c7修饰的脱氮腺嘌呤、c7修饰的脱氮鸟嘌呤、c5修饰的胞嘧啶或c5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，修饰包括甲基修饰、h修饰、cl修饰或f修饰中的一种或多种。
7、根据本专利技术的第二个方面，提供了一种核苷酸单体类似物，该核苷酸类似物的结构式如式ii所示：
8、式ii；
9、其中，r为碱基；r4包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；r5包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种；r6包括羟基或巯基。
10、进一步地，碱基包括天然碱基或非天然碱基；天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、c7修饰的脱氮腺嘌呤、c7修饰的脱氮鸟嘌呤、c5修饰的胞嘧啶或c5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，修饰包括甲基修饰、h修饰、cl修饰或f修饰中的一种或多种。
11、根据本申请的第三个方面提供了一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，该合成方法包括，a）当寡核苷酸链底物为单条时，将上述核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；
12、或b）当寡核苷酸链底物为两条时，寡核苷酸链底物包括第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物；其中，第一寡核苷酸链底物的3’端连接有上述的核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物；将第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。
13、进一步地，寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。
14、进一步地，非天然寡核苷酸链由非天然核苷酸组成。
15、进一步地，当核苷单体类似物的r2为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，合成方法包括：a-1）将核苷单体类似物和多聚磷酸盐混合，利用磷酸激酶催化，形成r2为三磷酸的核苷单体类似物；当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化r2为三磷酸的核苷单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-1）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；其中，磷酸激酶包括乙酸激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶、核苷激酶或核苷二磷酸激酶中的一种或多种。
16、进一步地，当核苷单体类似物的r2为三磷酸时，合成方法包括：a-2）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化r2为三磷酸的核苷单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-2）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。
17、进一步地，合成方法包括：a-3）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化核苷酸单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；
18、b-3）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述核苷酸单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。
19、进一步地，聚合酶包括pup聚合酶；连接酶包括t4连接酶。
20、根据本申请的第四个方面，提供了一种寡核苷酸的制备方法，该制备方法包括：脱除上述任一种的合成方法合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的3’端的可逆修饰端，获得寡核苷酸。
21、进一步地，脱除包括：将具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸和第一溶液混合，获得混合体系，利用混合体系实现3’端可逆修饰端的脱除。
22、进一步地，混合体系的ph为4~6，将混合体系在温度为20~40℃下维持5~10min，从而实现3’端可逆修饰端的脱除。
23、进一步地，第一溶液包括如下任意一种或多种：盐酸、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠，磷酸氢二钾、柠檬酸或硼酸。
24、进一步地，第一溶液中的溶质的浓度为0.01mm~10m。
25、根据本申请的第五个方面，提供了一种上述任一种核苷单体类似物，或上述任一种核苷酸单体类似物，或上述任一种的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，或上述任一种的寡核苷酸的制备方法，在制备寡核苷酸中的应用。
26、应用本专利技术的技术方案，利用具有式i结构的核苷单体类似物，能够使得3’可逆修饰端连接至寡核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核苷单体类似物，其特征在于，所述核苷单体类似物的结构式如式I所示；
2.根据权利要求1所述的核苷单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；
3.一种核苷酸单体类似物，其特征在于，所述核苷酸类似物的结构式如式II所示：
4.根据权利要求3所述的核苷酸单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；
5.一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。
7.根据权利要求5中任一项所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的R2为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，所述合成方法包括：
8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的R2为三磷酸时，所述合成方法包括：
9.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
10.根据权利要求
11.一种寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：脱除权利要求5~10中任一项所述的合成方法合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的3’端的所述可逆修饰端，获得所述寡核苷酸。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述脱除包括：
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述混合体系的pH为4~6，将所述混合体系在温度为20~40℃下维持5~10min，从而实现所述3’端可逆修饰端的脱除。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液包括如下任意一种或多种溶液：盐酸、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、柠檬酸或硼酸。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液中的溶质的浓度为0.01mM~10M。
16.权利要求1~2中任一项所述的核苷单体类似物、或权利要求3~4中任一项所述的核苷酸单体类似物、或权利要求5~10中任一项所述的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法、或权利要求11~15中任一项所述的寡核苷酸的制备方法在制备寡核苷酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种核苷单体类似物，其特征在于，所述核苷单体类似物的结构式如式i所示；
2.根据权利要求1所述的核苷单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；
3.一种核苷酸单体类似物，其特征在于，所述核苷酸类似物的结构式如式ii所示：
4.根据权利要求3所述的核苷酸单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；
5.一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。
7.根据权利要求5中任一项所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的r2为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，所述合成方法包括：
8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的r2为三磷酸时，所述合成方法包括：
9.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
10.根据权利要求7~9中任一项所述的合成方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，张娜，焦学成，刘芳，庞会宁，赵晓岚，马苁淙，胡蝶，马翠萍，崔丽心，朱文轩，项悦皓，
申请(专利权)人：天津凯莱英生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。