【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用甘薯高效生产虾青素的转基因育种方法，属于转基因。
技术介绍
1、虾青素是一种脂溶性类酮胡萝卜素，最初是从龙虾中分离出来，主要存在于多种藻类、微生物、甲壳类动物及海洋鱼类中，在高等植物中鲜有报道。虾青素含有13个共轭双键，具有极性-非极性-极性交替结构，使其能够跨越细胞和细胞器膜，因此比玉米黄质和叶黄素等表现出更强的抗脂质过氧化活性。虾青素的抗氧化活性可达维生素e的550倍，由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，虾青素可显著减少对dna、蛋白质和脂质的氧化损伤，减少炎症、延缓衰老、提高免疫力、防治糖尿病和心血管疾病等，已广泛用于制药、营养品、化妆品和水产养殖等行业。随着虾青素的营养保健品市场大幅增长，其需求量也大幅增加。化学合成和从微藻雨红球菌中提取是制备天然虾青素的主要方法，然而由于其高成本和技术壁垒，微藻衍生虾青素在商业生产中的占比不到1%。同时，合成虾青素表现出不同的立体化学，可能被副产品污染，这使得它不太适合人类直接食用。因此，利用高等植物尤其是重要农作物合成虾青素是生物强化工程的重要策略。由于植物中富含虾青素的前体β-类胡萝卜素，目前利用基因工程手段，已在烟草、番茄、土豆、水稻、玉米、小麦中实现了虾青素的合成。
2、甘薯是旋花科番薯属双子叶植物，俗称红薯、番薯、地瓜等，高产高抗且适应性强，因此是重要的粮食和工业原料作物。甘薯由于积累了不同的天然色素，包括类胡萝卜素和花青苷等，而使薯肉呈现不同的颜色。然而，甘薯中并没有虾青素合成途径的关键基因，因此无法产生酮类胡萝卜素。因此，通过甘薯为优势
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种在甘薯中合成虾青素的组合基因，重组载体及其在分子育种中的应用。
2、本专利技术提供了在甘薯种表达产生虾青素的组合基因及其应用，是在增强型植物超表达载体pcambia1300-dsred2-egfp的 kpni和 spei酶切位点之间连入组合基因 tp- ibor- r96h-2a- tp- shpbhy-2a- tp- crbkt ( obb)，构建其重组超表达载体，再基于发根农杆菌的原位转化技术，将重组超表达载体转入甘薯基因组中，筛选获得块根富含虾青素的转基因甘薯材料。该转基因甘薯植株不仅可以作为生产虾青素的优秀原料，而且还可以成为促进健康的功能性甘薯新种质。
3、本专利技术提供一种虾青素生物合成组合基因 obb，由能提高类胡萝卜素的积累的甘薯 ibor-r96h基因、参与虾青素合成的β-胡萝卜素羟化酶基因 shpbhy、参与虾青素合成的β-胡萝卜素酮化酶基因 crbkt通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成，所述甘薯 ibor- r96h基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述 shpbhy基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述 crbkt基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
4、本专利技术提供一种虾青素生物合成组合基因 obb，其组成顺序为： tp- ibor- r96h- 2a- tp- shpbhy-2a- tp- crbkt。甘薯 ibor-r96h基因能提高类胡萝卜素的积累，雨生红球藻 shpbhy基因可编码参与虾青素合成的β-胡萝卜素羟化酶，莱茵衣藻 crbkt基因可编码参与虾青素合成的β-胡萝卜素酮化酶。
5、上述的虾青素生物合成组合基因 obb，所述甘薯 ibor-r96h基因、 shpbhy基因、 crbkt基因的5’端分别与质体转运肽tp序列融合，并通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成至一个开放阅读框中，所述质体转运肽tp的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述 2a肽的核苷酸序列如seq id no.3和5所示。
6、本专利技术研究发现，参与虾青素合成的组合基因 obb，将其异源表达于甘薯植株中，可显著地提高虾青素的积累，对于通过基因工程技术定向培育富含虾青素的转基因甘薯新种质具有重要意义。
7、本专利技术还提供了含有参与虾青素合成的组合基因 obb的增强型重组超表达载体。
8、上述的增强型重组超表达载体，包括分别与含cor47-5′utr翻译起始增强子序列的2×35s启动子和hsp-t878终止子融合的 obb基因的表达盒。
9、上述的增强型重组表达载体，是在pcambia1300-dsred2-egfp载体的 kpni和 spei酶切位点之间连入虾青素生物合成组合基因 obb的核苷酸序列，具体如seq id no.1-seqid no.6所示。
10、本专利技术提供了含有上述增强型重组表达载体的微生物转化体。
11、上述微生物转化体为发根农杆菌k599。
12、本专利技术提供了如上述的虾青素生物合成组合基因 obb在制备转基因甘薯中的应用。
13、本专利技术进一步提供了如上述的虾青素生物合成组合基因 obb在甘薯合成虾青素中的应用。
14、本专利技术参与虾青素生物合成的组合基因 obb能够提高甘薯中虾青素的合成。将参与虾青素生物合成的组合基因 obb转入甘薯基因组中，在转基因甘薯中过表达，得到高虾青素含量的转基因甘薯。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种虾青素生物合成组合基因OBB，其特征在于，由能提高类胡萝卜素的积累的甘薯IbOR-R96H基因、参与虾青素合成的β-胡萝卜素羟化酶基因sHpBHY、参与虾青素合成的β-胡萝卜素酮化酶基因CrBKT通过编码可自行切割的2A肽序列依次串联组成，所述甘薯IbOR-R96H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sHpBHY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CrBKT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的虾青素生物合成组合基因OBB，其特征在于，所述甘薯IbOR-R96H基因、sHpBHY基因、CrBKT基因的5’端分别与质体转运肽TP序列融合，并通过编码可自行切割的2A肽序列依次串联组成至一个开放阅读框中，所述质体转运肽TP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述2A肽的核苷酸序列如SEQ ID No.3和5所示。
3.含有参与虾青素合成的组合基因OBB的增强型重组超表达载体。
4.根据权利要求3所述的增强型重组超表达载体，其特征在于，包括分别与含COR47-5′UTR翻译起始
5. 根据权利要求4所述的增强型重组表达载体，其特征在于，所述增强型重组表达载体是在pCAMBIA1300-DsRed2-eGFP载体的Kpn I和Spe I酶切位点之间连入虾青素生物合成组合基因OBB的核苷酸序列。
6.含有如权利要求3至5任一项所述增强型重组表达载体的微生物转化体。
7.根据权利要求6所述的微生物转化体，其特征在于，所述微生物转化体为发根农杆菌K599。
8.如权利要求1所述的虾青素生物合成组合基因OBB在制备转基因甘薯中的应用。
9.如权利要求1所述的虾青素生物合成组合基因OBB在甘薯合成虾青素中的应用。
10.一种在转基因甘薯中合成虾青素的分子育种方法，其特征在于，所述转基因材料的构建方法为：组合共表达虾青素合成的三个基因，包括IbOR-R96H基因、sHpBHY基因和CrBKT基因，三个基因的5’端分别与质体转运肽TP序列融合，并通过编码可自行切割的2A肽序列依次串联组成至一个开放阅读框中，构建其增强型重组超表达载体，转入发根农杆菌后并通过遗传转化获得富含虾青素的转基因甘薯。
...【技术特征摘要】
1.一种虾青素生物合成组合基因obb，其特征在于，由能提高类胡萝卜素的积累的甘薯ibor-r96h基因、参与虾青素合成的β-胡萝卜素羟化酶基因shpbhy、参与虾青素合成的β-胡萝卜素酮化酶基因crbkt通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成，所述甘薯ibor-r96h基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述shpbhy基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述crbkt基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
2.根据权利要求1所述的虾青素生物合成组合基因obb，其特征在于，所述甘薯ibor-r96h基因、shpbhy基因、crbkt基因的5’端分别与质体转运肽tp序列融合，并通过编码可自行切割的2a肽序列依次串联组成至一个开放阅读框中，所述质体转运肽tp的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述2a肽的核苷酸序列如seq id no.3和5所示。
3.含有参与虾青素合成的组合基因obb的增强型重组超表达载体。
4.根据权利要求3所述的增强型重组超表达载体，其特征在于，包括分别与含cor47-5′utr翻译起始增强子序列的2×35s启动子和hsp...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱明库，刘维威，孟小庆，吕雨蒙，王艺霏，于婧，洪海婷，黄灿，李非凡，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：
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