【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，具体涉及一种芸薹属植物叶片原生质体制备和转化的方法。
技术介绍
1、原生质体瞬时基因表达体系因其操作简单、转化周期短、转化效率高等优点，在植物基因功能研究和遗传改良中得到了广泛应用。然而，在芸薹属蔬菜作物中，原生质体制备和转化的效率相对较低。
2、参考申请号为cn201710916783.1的中国专利技术专利，公开了一种油菜原生质体的分离及转化方法，具体包括以油菜子叶或真叶为原材料，分析影响油菜叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素，确定适用于油菜的酶解、分离、纯化及转化的体系，最终以油菜原生质体为受体，利用合适浓度的peg介导，将整合了外源基因的表达载体转入油菜原生质体中，经过优化培养，使外源基因在油菜原生质体中成功表达。参考申请号为cn201910840640.6的中国专利技术专利，公开了一种大白菜的原生质体制备及遗传转化方法，包括从大白菜黄化内叶中得到大白菜原生质体的步骤。
3、参考现有技术存在以下缺点：1、关于芸薹属植物原生质体制备和转化的优化方法公开较少，仅可制备与转化芸薹属下单一植物的原生质体，并不适用于芸薹属下所有植物。2、且所选材料必须为实生苗，材料需用胶带预处理。3、酶解后需用蔗糖溶液纯化，实验条件要求苛刻，操作复杂。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种适用于所有芸薹属下植物叶片原生质体制备和转化的方法，保证实验材料可快速获取，实验操作流程简便，转化效率提高。
2、本申请所提供
3、步骤s1：选取1g芸薹属下植物(甘蓝、油菜、白菜、芥菜、青菜)新鲜健康的叶片，流水冲洗，并用吸水纸擦干，用锋利刀片平行主叶脉将其切为0.5-1mm条状；
4、步骤s2：将上述材料置入20ml酶解液中，25-28℃避光酶解，所述的酶解液配方为：0.75wt％纤维素酶，0.2wt％果胶酶，0.6m甘露醇(mannitol)，20mm kcl，20mm ph为5.7的mes，10mm cacl2，0.1wt％bsa；
5、步骤s3：酶解5h后，在酶解混合液中加入等体积w5溶液(4mm mes，154mm nacl，125mm cacl2，5mm kcl，2mm mes(ph5.7))离心洗涤原生质体，离心去上清后，用10mlw5溶液重悬原生质体，所得绿色溶液即为纯化后的原生质体；
6、步骤s4：将上述绿色溶液置于冰上避光静置30min；
7、步骤s5：离心去除w5溶液，用mmg溶液(0.4m mannitol，15mm mgcl2及4mm mes(ph5.7))重悬原生质体沉淀，重悬后细胞密度为1.5-2×105细胞/ml，备用；
8、步骤s6：原生质体转化：转化体系为10μg质粒，100μl原生质体-mmg悬混液，110μl40％peg-4000，轻柔混匀后，37℃水浴6min，再加入500μl w5溶液重新悬浮，终止转化；离心弃上清，加入500μlw5溶液重悬浮，室温培养12-16h。
9、本专利技术的技术效果和优点：
10、1、本专利技术方法可适用于不同程度的叶片，且无需特殊处理，通过简便的离心方式，增加了芸薹属下不同植物叶片的原生质体转化效率。
11、2、本专利技术通过改变酶的选择和用量、酶解缓冲液的配方，以此满足芸薹属下不同植物叶片的原生质体制备需求。通过改变mmg溶液和转化液配方、转化方法，以此满足芸薹属下不同植物叶片的原生质体转化需求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：
3.根据权利要求1所述的一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，所述酶解液的配方为：0.75wt％纤维素酶，0.2wt％果胶酶，0.6M甘露醇，20mM KCl，20mM pH为5.7的MES，10mM CaCl2，0.1wt％BSA。
4.根据权利要求1所述的一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，所述W5溶液的配方为：4mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，2mM pH为5.7的MES。
5.根据权利要求2所述的一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，所述MMG溶液的配方为：0.4M甘露醇，15mM MgCl2及4mM pH为5.7的MES。
6.根据权利要求1所述的一种芸薹属植物叶片原生质体制备的方法，其特征在于，所述芸薹属下植物包括但不限于甘蓝、油菜、白菜、芥菜、青菜。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。