【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种腺病毒p53负载的dc细胞疫苗制备方法。
技术介绍
1、p53基因是公认的"基因保护神"，在100多种人类肿瘤中，有60％以上的肿瘤发生与p53基因突变有关。通过腺病毒载体将外源性肿瘤抑制基因(p53基因)导入肿瘤内，通过细胞凋亡(apoptosis)、旁观者效应(by-stander effects)、抑制多药耐药基因(mdr)表达等多种抗肿瘤机制，抑制肿瘤组织的生长。目前临床已开展应用腺病毒介导的p53基因治疗各种恶性肿瘤，包括:头颈部肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、脑瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等。
2、树突状细胞(dendritic cells，dc)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(apc)，它能有效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟dc具有较强的迁移能力和摄取抗原能力，成熟的dc细胞能有效激活初始型t细胞，产生具有抗肿瘤活性的效应细胞；通过腺病毒p53(ad-p53)负载dc细胞可有效激活人体内抗肿瘤t细胞，而常规方法难以使p53基因整合到dc细胞，因此急需研发一种dc细胞纯度高，能够使dc细胞过表达ad-p53蛋白的培养方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种腺病毒p53负载的dc细胞疫苗制备方法，该方法最终制得的dc细胞，且能够使dc细胞过表达ad-p53蛋白，具有广阔的应用前景。
2、本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：
3、本专利技术提供了一种腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方
4、(1)采集外周血并进行离心处理，分离血浆层及去除血浆层的细胞层，并将血浆层再次离心，收集血浆层上清作为自体血浆备用，并将去除血浆层的细胞层与淋巴细胞分离液按照2∶1比例混匀后添加至含有淋巴细胞分离液的离心管中离心，后吸取白膜层收集pbmc，并再次进行离心洗涤处理；
5、(2)利用cd14磁珠对pbmc进行孵育分选，收集cd14+细胞和cd14-细胞，并将cd14+贴壁培养；
6、(3)将步骤(2)中贴壁培养完成的cd14+细胞弃上清，后加入dc完全培养基及步骤(1)中所制得的自体血浆，继续培养，即得dc细胞；
7、(4)将步骤(3)所制得的dc细胞经离心，重悬后置于含1mg/ml perminede无血清xvivo-15培养基中，利用ad-p53病毒进行转染，后继续培养；
8、(5)将步骤(4)中培养得到的dc细胞重悬于生理盐水中，即得所述dc细胞疫苗。
9、进一步的，在步骤(1)中，所述采集外周血并进行离心处理时的离心参数为2300rpm离心15min，所述将血浆层再次离心时的离心参数为2700rpm离心10min，所述血浆层在再次离心之前还包括56℃水浴30min的步骤。
10、进一步的，在步骤(1)中，所述pbmc的具体分离方法为ficoll密度梯度离心法，所述淋巴细胞分离液为ficoll，所述添加至含有淋巴细胞分离液的离心管中离心时的参数为2000rpm，离心20min，所述再次进行离心洗涤处理时离心参数为1500rpm，离心5min。
11、进一步的，在步骤(2)中，所述孵育为采用80μlbuffer+20μl cd14磁珠2-8℃避光条件下孵育30min，其中，每5μl磁珠孵育1e7个pbmcs。
12、进一步的，在步骤(3)中，所述dc完全培养基的成分为50ng/ml il-4和100ng/mlgm-csf，所述自体血浆的添加量为2％，所述继续培养为在37℃，5％co2的培养箱中继续培养。
13、进一步的，在步骤(4)中，所述离心的参数为1800rpm 5min，所述含1mg/mlperminede无血清xvivo-15培养基含l-gln,phenolred。
14、进一步的，在步骤(4)中，所述转染为按照1×106个dc细胞，感染复数为moi＝25000：1按比例进行添加病毒ad-p53，后室温孵育120min，按照1500rpm，5min进行离心，离心完毕后吸弃上清添加含5％自体血浆的dc完全培养基。
15、进一步的，在步骤(5)中，所述重悬为将转染后的dc细胞按照5×106/ml的细胞密度重悬于2ml0.9％的生理盐水中。
16、本专利技术还提供了一种利用所述的制备方法制备得到的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗。
17、本专利技术还提供了一种所述的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗在制备抗肿瘤产品中的应用。
18、有益效果：
19、常规感染dc细胞方式不能有效提高dc细胞ad-p53蛋白表达，而本专利技术通过dc细胞纯化以及特定的感染复数和感染方式能提升p53的感染率；且利用腺病毒作为转染工具可提高病毒感染率，利用p53蛋白替代目前现有通用的肿瘤相关抗原(taa)技术作为疫苗主要构件具有更为明显的抗原递呈作用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述采集外周血并进行离心处理时的离心参数为2300rpm离心15min，所述将血浆层再次离心时的离心参数为2700rpm离心10min，所述血浆层在再次离心之前还包括56℃水浴30min的步骤。
3.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述PBMC的具体分离方法为Ficoll密度梯度离心法，所述淋巴细胞分离液为Ficoll，所述添加至含有淋巴细胞分离液的离心管中离心时的参数为2000rpm，离心20min，所述再次进行离心洗涤处理时离心参数为1500rpm，离心5min。
4.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述孵育为采用80μL buffer+20μL CD14磁珠2-8℃避光条件下孵育30min，其中，每5μL磁珠孵育1E7个PBMCs。
5.如权利要求1
6.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述离心的参数为1800rpm 5min，所述含1mg/mL Perminede 无血清XVIVO-15培养基含L-Gln, Phenol Red 。
7.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述转染为按照1×106个DC细胞，感染复数为MOI=25000：1按比例进行添加病毒Ad-P53，后室温孵育120min，按照1500rpm，5min进行离心，离心完毕后吸弃上清添加含5%自体血浆的DC完全培养基。
8.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述重悬为将转染后的DC细胞按照5×106/mL的细胞密度重悬于2mL0.9%的生理盐水中。
9.一种利用权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗。
10.如权利要求9所述的腺病毒p53负载的DC细胞疫苗在制备抗肿瘤产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述采集外周血并进行离心处理时的离心参数为2300rpm离心15min，所述将血浆层再次离心时的离心参数为2700rpm离心10min，所述血浆层在再次离心之前还包括56℃水浴30min的步骤。
3.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述pbmc的具体分离方法为ficoll密度梯度离心法，所述淋巴细胞分离液为ficoll，所述添加至含有淋巴细胞分离液的离心管中离心时的参数为2000rpm，离心20min，所述再次进行离心洗涤处理时离心参数为1500rpm，离心5min。
4.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述孵育为采用80μl buffer+20μl cd14磁珠2-8℃避光条件下孵育30min，其中，每5μl磁珠孵育1e7个pbmcs。
5.如权利要求1所述的腺病毒p53负载的dc细胞疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述dc完全培养基的成分为 50ng...
【专利技术属性】
技术研发人员：迪奥斯达德·鲍蒂斯塔，徐卫，胡爱国，叶茂，
申请(专利权)人：赛诺生深圳基因产业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。