【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种mrna疫苗组合物及其应用，特别涉及一种高致病性prrsvmrna疫苗组合物及其应用。本专利技术属于生物医药。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome，prrs)于20世纪80年代首次在北美出现，随后传播到欧洲。从那时起，这种疾病就在世界范围内蔓延，并演变成养猪业中最具破坏性的疾病之一，以生殖衰竭和呼吸道疾病为主要特征。prrs病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，prrsv)是一种单股正链，有囊膜的rna病毒，属于动脉炎病毒科套式病毒目，全长基因组约为15kb。其基因组包含至少10个开放阅读框(orf)，orf1a和orf1b占病毒基因组的三分之二以上，编码14个非结构蛋白，包括nsp1a、nsp1b、nsp2-6、nsp7a、nsp7b、nsp8-12是病毒复制所必需的；而orfs 2-7编码8种结构蛋白，包括糖蛋白(gp2)、包膜蛋白(e)、gp3、gp4、gp5、orf5a、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n)。prrsv主要包括两种基因型，基因ⅰ型(欧洲型)和ⅱ型(北美型)，不同基因型之间的全基因组差异高达40％，同一基因型不同毒株间差异高达20％。prrsv易感单核-巨噬细胞，感染后抑制宿主的细胞免疫应答，延迟中和抗体的产生。其高度的遗传变异和复杂的致病机制使prrsv的防控困难。尽管已经做出了巨大努力来减轻prrsv的影响，但prrsv目前仍未得到充分
2、mrna疫苗因其高效的开发速度和提供抵御病毒攻击的潜力而受到广泛关注，与减毒活疫苗和灭活疫苗等传统疫苗相比，mrna疫苗在安全性、有效性和工业生产方面都有卓越的优势。尽管抗原由mrna编码，但疫苗生产中的一致技术简化了这一过程，确保了及时和可扩展的疫苗开发。目前已有多种传染性疾病的mrna疫苗取得了较好得研究进展。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高致病性prrsv mrna疫苗组合物及其应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
3、本专利技术以高致病性prrsv jx-a1毒株为模板开发prrsv mrna疫苗，选择prrsv jx-a1毒株的gp3、gp4、gp5、m和n蛋白作为抗原，同时对gp5蛋白的糖基化位点进行了突变，以提高中和性抗体的产生。构建合成了融合蛋白gp345、gp5m、gp5mn和单个结构蛋白gp3、gp4、gp5、m、n的mrna。脂质体包封后获得mrna-lnps疫苗，以融合蛋白mrna-lnps和相应单个蛋白的mrna-lnps混合免疫小鼠，评价其在小鼠体内的免疫效果。结果表明单个mrna-lnps混合组的体液免疫和细胞免疫水平均高于重组mrna-lnps，其中gp5+m+n，gp3+4+5效果相对最好。
4、因此，在上述研究的基础上，本专利技术提出了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒mrna疫苗组合物，所述的疫苗组合物选自以下组合中的任一：
5、(1)由prrsv gp3 mrna、prrsv gp4 mrna以及prrsv gp5 mrna组成的mrna疫苗组合物；或
6、(2)由prrsv gp5 mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna组成的mrna疫苗组合物。
7、其中，优选的，所述的prrsv gp3 mrna、prrsv gp4 mrna、prrsv gp5mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna是分别由seq id no.4-8所示的序列经转录后得到n1-甲基假尿嘧啶修饰的mrna。
8、其中，优选的，所述的prrsv gp5 mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna按照等摩尔比混合。
9、其中，优选的，所述的prrsv gp3 mrna、prrsv gp4 mrna以及prrsv gp5 mrna按照等摩尔比混合。
10、进一步的，本专利技术还提出了所述的mrna疫苗组合物在制备预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的mrna疫苗中的应用。
11、再进一步的，本专利技术还提出了一种预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的mrna疫苗，所述的疫苗中含有所述的mrna疫苗组合物。
12、其中，优选的，所述的疫苗中还含有脂质，所述的脂质包括可电离脂质alc-0315，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇以及聚脂质dmg-peg2000。
13、其中，优选的，所述的mrna疫苗通过以下方法制备得到：
14、(1)将可电离脂质alc-0315，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇、聚脂质dmg-peg2000溶解在乙醇中，得到脂质；
15、(2)将所述prrsv gp3 mrna、prrsv gp4 mrna以及prrsv gp5mrna的混合物或者将prrsv gp5 mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna的混合物溶解于20mm，ph4.5的柠檬酸缓冲液中，得到mrna溶液；
16、(3)将步骤(1)得到的脂质和步骤(2)得到的mrna溶液以脂质与mrna在微流体混合器中制备得到脂质纳米颗粒(lnps)；
17、(4)lnps在无rnase的ph 7.4磷酸盐缓冲液中透析24h，去除乙醇。最后，lnps通过0.22μm的滤器过滤，并存储在4℃直到使用。
18、其中，优选的，步骤(1)中可电离脂质alc-0315，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇、聚脂质dmg-peg2000的摩尔比为46.3：9.4：42.7：1.6，总脂质浓度为19.1mm；步骤(2)中将所述的prrsvgp3 mrna、prrsv gp4mrna以及prrsv gp5 mrna按照等摩尔比混合，或者将所述的prrsv gp5mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna按照等摩尔比混合，根据氮磷比为1:6计算出mrna的用量，将mrna溶解于20mm，ph 4.5的柠檬酸缓冲液中。
19、其中，优选的，步骤(3)中将步骤(1)得到的脂质和步骤(2)得到的mrna溶液以体积比为1：3的比例在微流体混合器中制备得到脂质纳米颗粒(lnps)
20、相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
21、1、本专利技术基于hp-prrsv jx-a1株设计了数种prrsv mrna疫苗，并在小鼠体内进行了详细的免疫评价，证明了mrna疫苗在预防prrsv感染方面的潜力；
22、2、本专利技术构建制备了prrsv融合蛋白和单本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物选自以下组合中的任一：
2.如权利要求1所述的mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述的PRRSV GP3mRNA、PRRSVGP4 mRNA、PRRSV GP5 mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣壳蛋白mRNA是分别由SEQ IDNO.4-8所示的序列经转录后得到N1-甲基假尿嘧啶修饰的mRNA。
3.如权利要求1或2所述的mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述的PRRSV GP5 mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣壳蛋白mRNA按照等摩尔比混合。
4.如权利要求1或2所述的mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述的PRRSV GP3 mRNA、PRRSV GP4 mRNA以及PRRSV GP5 mRNA按照等摩尔比混合。
5.权利要求1-4任一项所述的mRNA疫苗组合物在制备预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征
6.一种预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的mRNA疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有权利要求1-4任一项所述的mRNA疫苗组合物。
7.如权利要求6所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的疫苗中还含有脂质，所述的脂质包括可电离脂质ALC-0315，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇以及聚脂质DMG-PEG2000。
8.如权利要求7所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗通过以下方法制备得到：
9.如权利要求8所述的mRNA疫苗，其特征在于，步骤(1)中可电离脂质ALC-0315，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、聚脂质DMG-PEG2000的摩尔比为46.3：9.4：42.7：1.6，总脂质浓度为19.1mM；步骤(2)中将所述的PRRSV GP3 mRNA、PRRSV GP4 mRNA以及PRRSV GP5 mRNA按照等摩尔比混合，或者将所述的PRRSV GP5 mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣壳蛋白mRNA按照等摩尔比混合，根据氮磷比为1:6计算出mRNA的用量，将mRNA溶解于20mM，pH4.5的柠檬酸缓冲液中。
10.如权利要求9所述的mRNA疫苗，其特征在于，步骤(3)中将步骤(1)得到的脂质和步骤(2)得到的mRNA溶液以体积比为1：3的比例在微流体混合器中制备得到脂质纳米颗粒(LNPs)。
...【技术特征摘要】
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，prrsv)mrna疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物选自以下组合中的任一：
2.如权利要求1所述的mrna疫苗组合物，其特征在于，所述的prrsv gp3mrna、prrsvgp4 mrna、prrsv gp5 mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna是分别由seq idno.4-8所示的序列经转录后得到n1-甲基假尿嘧啶修饰的mrna。
3.如权利要求1或2所述的mrna疫苗组合物，其特征在于，所述的prrsv gp5 mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣壳蛋白mrna按照等摩尔比混合。
4.如权利要求1或2所述的mrna疫苗组合物，其特征在于，所述的prrsv gp3 mrna、prrsv gp4 mrna以及prrsv gp5 mrna按照等摩尔比混合。
5.权利要求1-4任一项所述的mrna疫苗组合物在制备预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的mrna疫苗中的应用。
6.一种预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的mrna疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，柳海云，孙世琪，麻玉清，滕志东，江丽馨，乔璐，张韵，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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