【技术实现步骤摘要】
本申请涉及植物学，尤其涉及一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法。
技术介绍
1、石斛属（ dendrobium）是兰科重要的观赏花卉和药用植物，深受国人的喜爱。目前关于石斛的选育以杂交为主，但由于石斛种子本身具有特殊的生物学特性，没有胚乳，非常细小，自然条件下，其繁殖率低，生长周期长。因此，传统育种方式具有生长周期长，效率低等缺点。与传统育种方法相比，化学诱变育种是一种快速有效的育种方法，对植物品种改良具有特别重要的意义。甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，ems）是一种烷化剂，可通过改变dna中碱基对改变，导致基因突变，诱发植物表型发生变异，是目前作物诱变育种中应用最为广泛、效果最好的一种化学诱变剂。半致死剂量（median lethal dose，ld50）是用于诱变育种的最佳剂量。
2、石斛属植物由于没有胚乳，种子细小如粉尘，种子无菌萌发的过程，需要附着于培养基上获取营养，但难于再收集。目前，石斛ems诱变育种的诱变材料主要是原球茎和类原球茎。现有技术中，尚未见到有关利用石斛种子直接进行ems诱变的相关报道。利用原球茎和类原球茎作为诱变材料，由于其组织体积较大，诱变剂渗入其细胞较难，因而往往诱变效率低，且容易产生嵌合体。现有技术中公开的利用类原球茎作为诱变材料进行ems诱变时，ld50为0.8 % ems 处理 90 min或者ld50为1.8 % ems 处理4h；而在利用原球茎作为诱变材料进行ems诱变时，ld50为1.0 %
技术实现思路
1、为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本申请提供一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法，直接将石斛种子作为ems诱变材料，在种子刚萌动时进行ems诱变，结果显示ld50为：ems体积浓度为0.4 %，处理时间4 h；相比较现有技术中使用石斛原球茎和类原球茎作为诱变材料的半致死剂量，使用刚萌动的种子作为诱变材料达到半致死剂量的ems剂量明显减少。
2、本申请一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法，包括以下步骤：
3、（1）石斛种子消毒
4、对石斛果荚进行消毒处理；
5、（2）播种
6、将消毒处理后的石斛果荚切开，将种子播种于表面铺了无菌玻璃纸的萌发培养基上；
7、（3）种子培养
8、将播种后的种子培养至种子刚萌动；
9、（4）种子诱变
10、将刚萌动的种子浸泡于体积浓度为0.4 %的ems溶液中，在25±2℃、震荡条件下诱变4h；然后，在ems溶液中添加质量浓度为25%的硫代硫酸钠溶液终止诱变，其中，质量浓度为25%的硫代硫酸钠溶液与ems溶液的体积比为1：4；混匀后静置10 min，去除上清液，用灭菌蒸馏水清洗终止诱变后的种子，即得诱变的石斛种子。
11、进一步地，所述步骤（1）中对石斛果荚进行消毒处理的具体操作为：将石斛果荚置于质量浓度75 %酒精中浸泡3 min，用无菌蒸馏水洗2次；再用质量浓度为0.1 %的升汞浸泡灭菌8 min，用无菌蒸馏水洗3次；再用质量浓度为1 %的次氯酸钠浸泡灭菌5 min，用无菌蒸馏水洗10次。
12、进一步地，所述将终止反应后的种子用灭菌蒸馏水清洗具体操作为：在离心管中每次加40 ml蒸馏水，颠倒混匀10次后静置，待种子沉至管底后，吸干上清液；重复该操作10次。
13、进一步地，还包括将诱变后石斛种子播种和培养的步骤，其播种具体操作为：将诱变后石斛种子用无菌蒸馏水重悬后，将重悬液铺在装有固体播种培养基的培养瓶中；其培养具体操作为：将培养瓶置于温度25±2 °c、光照12 h/d、光照强度为2000-3000 lx条件下培养。
14、进一步地，所述萌发培养基的配方为：1/2 ms、 1 mg/l 6-ba、 0.1 mg/l naa、20g/l蔗糖、0.3 % 活性炭、7 g/l 琼脂、ph5.8。
15、本申请的有益效果为：
16、本申请首次将石斛种子作为ems诱变材料，利用本申请中的方法对石斛种子进行ems诱变，结果显示ld50为：ems体积浓度为0.4 %，处理时间4 h，该结果说明本申请中的方法只需要较低的ems剂量即可达到ld50，即本申请中的诱变方法更加高效。
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1.一种应用石斛种子进行EMS高效诱变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行EMS高效诱变的方法，其特征在于，所述步骤（1）中对石斛果荚进行消毒处理的具体操作为：将石斛果荚置于质量浓度75 %酒精中浸泡3 min，用无菌蒸馏水洗2次；再用质量浓度为0.1 %的升汞浸泡灭菌8 min，用无菌蒸馏水洗3次；再用质量浓度为1 %的次氯酸钠浸泡灭菌5 min，用无菌蒸馏水洗10次。
3.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行EMS高效诱变的方法，其特征在于，所述将终止反应后的种子用灭菌蒸馏水清洗的具体操作为：在离心管中每次加40 mL蒸馏水，颠倒混匀10次后静置，待种子沉至管底后，吸干上清液；重复上述操作10次。
4.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行EMS高效诱变的方法，其特征在于，还包括将诱变后石斛种子播种和培养的步骤，其播种具体操作为：将诱变后石斛种子用无菌蒸馏水重悬后，将重悬液铺在装有固体播种培养基的培养瓶中；其培养具体操作为：将培养瓶置于温度25±2 °C、光照12 h/d、光照强度为2000
5.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行EMS高效诱变的方法，其特征在于，所述萌发培养基的配方为：1/2 MS、1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、20 g/L蔗糖、0.3 % 活性炭、7 g/L 琼脂、pH5.8。
...【技术特征摘要】
1.一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法，其特征在于，所述步骤（1）中对石斛果荚进行消毒处理的具体操作为：将石斛果荚置于质量浓度75 %酒精中浸泡3 min，用无菌蒸馏水洗2次；再用质量浓度为0.1 %的升汞浸泡灭菌8 min，用无菌蒸馏水洗3次；再用质量浓度为1 %的次氯酸钠浸泡灭菌5 min，用无菌蒸馏水洗10次。
3.根据权利要求1所述的一种应用石斛种子进行ems高效诱变的方法，其特征在于，所述将终止反应后的种子用灭菌蒸馏水清洗的具体操作为：在离心管中每次加40 ml蒸馏水，颠倒混匀10次后静置，待种子...
【专利技术属性】
技术研发人员：董秀梅，李润渝，张石宝，沈定才，周莹，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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