【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蔗糖异构酶突变体及其在异麦芽酮糖生产中的应用，属于酶工程。
技术介绍
1、异麦芽酮糖(isomaltulose)，又称帕拉金糖一水合物(c12h22o11·h2o)，蔗糖异构体，是葡萄糖和果糖以α-1，6糖苷键相连的二糖。白色结晶，无臭、味甜、甜度约为蔗糖的42％，无不良后味，熔点122-124c，比旋光度α20d为+97.2°。与蔗糖相比，耐酸，耐热，不易水解，热稳定性较差。易溶于水，不溶于乙醇，其水溶液的黏度和溶解度比相同条件下的蔗糖低。
2、在食品加工方面，异麦芽酮糖吸湿性极低，不易结块，因此它在速溶粉末中具有自由流动性，在面包类产品中保持产品质构，避免糖果粘度增加和形变，保持各类食品理化性质稳定；其优良的耐酸性可以在含有机酸或维生素c的食品中保持稳定；大多数微生物不能利用异麦芽酮糖，有利于延长食品货架期。基于上述特性，异麦芽酮糖可以成为为蔗糖的替代。常见的异麦芽酮糖制备方法包括天然提取法、化学合成法和生物合成法。异麦芽酮糖天然存在于甘蔗和蜂蜜中，含量极低，提取法获得异麦芽酮糖不仅操作复杂且成本极高，不利于工业化生产。化学合成法因其操作过程中的副产物未知且污染环境，从而未被广泛应用。生物合成法包括微生物转化法和酶转化法，前者是利用微生物代谢系统生产异麦芽酮糖，后者则是利用微生物分泌表达出蔗糖异构酶，经提取纯化后用于蔗糖异构化生成异麦芽酮糖。针对酶转化法又分为游离酶转化和固定化酶转化，固定化酶转化法能快速分离酶和底物，能在多次反应后仍保持酶活性，但固定化材料和工艺仍需进一步优化研究；游离酶转化法中酶
3、与葡萄糖苷酶家族其他酶相比，蔗糖异构酶(si)最适酶反应条件更加接近工业生产条件且被认为是最有异麦芽酮糖生产前景的酶，但是，其酶活力仍较低，导致异麦芽酮糖产量低，因此，需要进一步提升si催化蔗糖向异麦芽酮糖转化的能力。
技术实现思路
1、针对上述现有技术中的不足，本专利技术提供了蔗糖异构酶突变体及其在异麦芽酮糖生产中的应用，目的在于解决现有蔗糖异构酶(si)酶活力仍较低，导致异麦芽酮糖产量低的技术问题。
2、本专利技术提供的第一个技术方案为蔗糖异构酶突变体，所述突变体是对蔗糖异构酶亲本的第522位苏氨酸、第340位赖氨酸、第222位天冬氨酸和第467位甘氨酸中的一个或多个进行突变，所述亲本的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、在某些实施方式中，所述突变体是对所述亲本进行了如下(a)-(g)任一项所示的突变：
4、(a)将第522位的苏氨酸t突变为丝氨酸s；
5、(b)将第340位的赖氨酸k突变为天冬氨酸d；
6、(c)将第222位的天冬氨酸d突变为组氨酸h；
7、(d)将第467位的甘氨酸g突变为天冬酰胺n；
8、(e)将第522位的苏氨酸t突变为丝氨酸s和将第340位的赖氨酸k突变为天冬氨酸d；
9、(f)将第340位的赖氨酸k突变为天冬氨酸d和将第222位的天冬氨酸d突变为组氨酸h；
10、(g)将第340位的赖氨酸k突变为天冬氨酸d和将第467位的甘氨酸g突变为天冬酰胺n。
11、在某些实施方式中本专利技术提供的第二个技术方案为编码第一技术方案所述突变体的基因。
12、本专利技术提供的第三个技术方案为携带第二个技术方案所述基因的表达载体。
13、在某些实施方式中，所述载体包括但不限于质粒，可选但不限定的，所述质粒为pp43系列质粒。
14、进一步可选但不限定为pp43nmk质粒。
15、本专利技术提供的第四个技术方案是表达有第一个技术方案所述突变体，或者含有第二个技术方案所述基因，或者转化有第三个技术方案所述表达载体的重组细胞。
16、在某些实施方式中，所述重组细胞为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
17、在某些实施方式中，所述微生物细胞为真菌或细菌。
18、在某些实施方式中，所述为重组细胞以枯草芽孢杆菌为出发菌株。
19、在某些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为bacillus subtiliswb800。
20、本专利技术提供第五个技术方案为一种制备异麦芽酮糖的方法，所述方法包括在以蔗糖为底物，利用第一个技术方案所述的突变体作为催化剂组成催化体系，催化生成异麦芽酮糖。
21、在某些实施方式中，所述催化体系中，所述蔗糖的浓度为200g/l，所述催化剂的投加量为20u/g的突变体。
22、在某些实施方式中，所述催化的温度为35～40℃，所述催化的时间为7～12h，，可选地，所述催化的时间为7～8.5h。
23、在某些实施方式中，所述催化体系的ph为4～10。可选为ph 7.0。
24、在某些实施方式中，所述的蔗糖异构酶突变体粗酶液的制备方法如下：将所述重组细胞种子液添加至发酵培养基中，于20～37℃，150～250rpm的条件下培养24～48h，离心后得粗酶液；所述重组细胞以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis wb800为宿主细胞，以质粒以pp43nmk为表达载体，表达第一个技术方案所述蔗糖异构酶突变体。
25、在某些实施方式中，所述细胞种子液制备方法为：接种重组细胞于lb液体培养基中，在35～40℃，150～250rpm，摇瓶培养8～12h。
26、在某些实施方式中，所述方法包括：将所述细胞接种于lb液体培养基中，在37℃，200rpm，摇瓶培养12h，将种子液按照1％(v/v)的量接种于发酵培养基，菌株在25～30℃，150～250rpm的条件下培养不少于24h。
27、在某些实施方式中，所述发酵培养基含有：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物20g/l，氯化钠8g/l，葡萄糖15g/l，十二水合磷酸氢二钠1g/l，七水合硫酸镁1g/l。
28、本专利技术提供的第六个技术方案为第一技术方案所述的蔗糖异构酶突变体、第二个技术方案所述的基因、第三技术方案所述的表达载体、第四技术方案所述的重组细胞或第五技术方案所述的方法在制备异麦芽酮糖或含异麦芽酮糖产品中的应用。
29、本专利技术提供的第七个技术方案为蔗糖异构酶在制备异麦芽酮糖中的应用，以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶作为催化剂组成催化体系，催化生成异麦芽酮糖，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
30、本专利技术的技术效果如下：
31、(1)本专利技术以serratia plymuthica来源的蔗糖异构酶为亲本酶进行分子改造，对第522位，第222位，第340位或第467位中的至少一个氨基酸进行了突变，获得了一系列酶活提高的突变体。
32、(2)本专利技术提供的一系列蔗糖异构酶突变体比酶活相比于野生酶均有了明显的提高，单点突变体t522s、k340d、d22本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.蔗糖异构酶在制备异麦芽酮糖中的应用，其特征在于，以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶作为催化剂组成催化体系，催化生成异麦芽酮糖，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是对蔗糖异构酶亲本的第522位苏氨酸、第340位赖氨酸、第222位天冬氨酸和第467位甘氨酸中的一个或多个进行突变，所述亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体是对所述亲本进行了如下(a)-(g)任一项所示的突变：
4.编码权利要求2或3所述突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的表达载体。
6.表达有权利要求2或3所述突变体，或者含有权利要求4所述基因，或者转化有权利要求5所述表达载体的重组细胞。
7.一种制备异麦芽酮糖的方法，其特征在于，所述方法包括在以蔗糖为底物，利用权利要求2或3所述的突变体作为催化剂组成催化体系，催化生成异麦芽酮糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化体系中，所述蔗糖的浓
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化的温度为35～40℃，所述催化的时间为7～12h，所述催化体系的pH为4～10。
10.权利要求2或3所述的蔗糖异构酶突变体、权利要求4所述的基因、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的重组细胞或权利要求7～9任一项所述的方法在制备异麦芽酮糖或含异麦芽酮糖产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.蔗糖异构酶在制备异麦芽酮糖中的应用，其特征在于，以蔗糖为底物，利用蔗糖异构酶作为催化剂组成催化体系，催化生成异麦芽酮糖，所述蔗糖异构酶的氨基酸序列如seqid no.1所示。
2.蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是对蔗糖异构酶亲本的第522位苏氨酸、第340位赖氨酸、第222位天冬氨酸和第467位甘氨酸中的一个或多个进行突变，所述亲本的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体是对所述亲本进行了如下(a)-(g)任一项所示的突变：
4.编码权利要求2或3所述突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的表达载体。
6.表达有权利要求2或3所述突变体，或者含有权利要求4所述基因，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，刘晨，江波，李梦丽，张刘浩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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