本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种趋化素功能活性体的制备方法及应用。具体的，发明专利技术人基于在科学研究中发现昆虫细胞sf9在所述方法条件情形下能够特异识别切割人源分泌蛋白信号肽MRRLLIPLALWLGAVGVGVA的前期基础上，研发一种通过昆虫细胞分泌途径进行特异性信号肽切割，制备N端第一个氨基酸为非起始密码子甲硫氨酸的趋化素功能活性体的技术方案，实现可溶表达，并提供经过优化的超滤纯化技术体系。本发明专利技术方法简单高效，无需柱层析，无需对蛋白进行后期酶切加工，并且制备的趋化素功能活性体不含干扰正常折叠和功能的多余氨基酸或标签序列，为趋化素功能活性体的大量制备和用于抗炎解脂研发研究提供了良好的条件。
1、趋化素是一种重要的非典型趋化因子和脂肪因子，也被称为视黄酸受体反应蛋白2和他扎罗汀诱导蛋白2。趋化素通过两种g蛋白偶联受体，趋化素受体1和趋化素受体2，发挥生物功能。趋化素和趋化素受体表达于免疫组织和白色脂肪组织，近年被发现在白细胞趋化、脂肪细胞分化及脂肪分解中发挥重要作用，能够调控炎症和肥胖发生发展。
2、趋化素在生理下表达分泌需要经过步骤复杂的酶切和加工，才能形成具有生理功能的功能活性体。趋化素首先表达翻译为趋化素原体，包含163个氨基酸。在分泌成熟过程中，切除n端20个氨基酸的信号肽。此外，还需要在c端水解部分氨基酸，形成功能活性体。其中，功能活性最高的形式为，切除c端6个氨基酸后包含原体21-157位氨基酸的一种157氨基酸功能活性体形式。趋化素功能活性体包含3对二硫键，更为重要的是特殊加工和折叠过程，难以在大肠杆菌等原核生物中正确折叠。趋化素在大肠杆菌中重组表达为包涵体形式。包涵体变复性纯化后，生物功能与人工合成的c端9肽接近，表明其n端结构域未正确折叠。进一步研究表明，包涵体变复性纯化的趋化素无法与趋化素受体形成双位点结合模式，表明趋化素的n端结构域，难以自发完成正确的组装折叠。
3、我们在研究中发现，趋化素与趋化素受体的相互作用分为两个区域，cbr1和cbr2。人工合成趋化素的c端9肽，仅具有cbr2的相互作用，具有明显的生理功能缺陷。n端结构域正确折叠的趋化素功能活性体，具有完整的生理功能。
/>技术实现思路
1、本专利技术提供一种通过重组表达提纯，制备一种趋化素功能活性体的方法，为趋化素的进一步功能研究和抗炎降脂应用提供一种蛋白制备方法。本专利技术制备的趋化素功能活性体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2、本专利技术提供以下技术解决方案：
3、本专利技术提供一种优选的重组人趋化素蛋白核苷酸序列，如seq id no.2所示。
4、本专利技术提供一种通过昆虫细胞分泌表达重组人趋化素功能活性体的方法，包括以下步骤：
5、(1)将核苷酸序列seq id no.2同源重组引入杆粒，感染昆虫细胞。
6、(2)通过离心去除细胞及碎片，收获含有目的蛋白的澄清溶液。
7、优选地，步骤(1)昆虫细胞为sf9昆虫细胞。
8、优选地，步骤(1)感染比例moi为1。
9、优选地，步骤(2)收取培养产物时间是加入杆粒后96小时。
10、优选地，步骤(2)离心加速度采用2000g-4000g，减少细胞内容物释放。
11、本专利技术提供一种从所述表达产物中提纯趋化素功能活性体的方法，包括以下步骤：
12、(1)加入氯化钙引入氯离子和钙离子，沉淀培养基中溶解的杂质离子。
13、(2)加入tris碱调节溶液ph至7.4，并稳定ph环境。
14、(3)离心去除不溶沉淀物，并通过微孔滤膜进一步去除微小沉淀。
15、(4)采用大孔径超滤膜，去除大分子量蛋白杂质。
16、(5)通过小孔径超滤膜，浓缩目的蛋白趋化素，并置换溶液成分为生理盐水和缓冲盐。
17、优选的，步骤(3)离心转速为4500转每分，离心时间为30分钟。
18、优选的，步骤(3)微孔滤膜孔径为0.2至0.45微米。
19、优选的，步骤(4)超滤膜截留大小为30kd至1000kd，或孔径大小为5纳米至100纳米。
20、优选的，步骤(5)超滤膜截留大小为3kd。
21、本专利技术还提供了一种所述重组人趋化素功能活性体在炎症和脂肪调节的研究及研发的用途。
22、本专利技术的有益效果：
23、（1）本专利技术提供的重组表达方法，采用分泌表达。重组蛋白分泌至大体积的培养基中，相比于细胞内或细菌内的小体积表达，产率更高。
24、（2）本专利技术提供的重组表达方法，是基于专利技术人的研究发现昆虫细胞能够有效识别并切割信号肽氨基酸序列mrrlliplalwlgavgvgva。通过设计一种在昆虫细胞分泌过程中切割信号肽的技术方案，突破趋化素功能活性体的第一个氨基酸为谷氨酸而并非起始密码子对应的甲硫氨酸的重组表达的技术难点瓶颈，而目前大多数蛋白的重组表达都需要把第一个氨基酸设计为起始密码子对应的甲硫氨酸。
25、（3）本专利技术提供的重组表达方法，采用接种杆粒进行表达。杆粒能够自我复制，并回收重复使用。相比于哺乳细胞重组表达所需进行繁琐的大量质粒提取，本专利技术所述的制备方法仅需进行2次dna小量提取。
26、（4）本专利技术提供的制备方法，步骤简单，无需亲和柱层析、凝胶排阻柱层析等柱层析步骤和蛋白标签的体外酶切加工等提高成本和限制产率的瓶颈步骤。便捷的操作流程，提高了效率并降低了成本，为本专利技术的应用奠定了充分基础。
27、（5）本专利技术提供的制备方法，无多余氨基酸引入。而常规重组表达方法需要融合用于纯化的标签序列，这些标签序列对趋化素的折叠和功能产生影响。此外，完全去除标签且不留下多余氨基酸，也是蛋白质工程领域一个高成本且限速的步骤。
28、（6）本专利技术的提供的制备过程，无内毒素引入。通过细菌重组表达并提纯的常规方法，现有技术下内毒素难以被完全去除，而细菌来源的内毒素本身就具有免疫效应，能够引起炎症。低含量的内毒素也会干扰免疫炎症相关研究的实验结果。
29、（7）本专利技术制备的趋化素，已证明能够结合趋化素已知的所有功能受体，即趋化素受体1和趋化素受体2，并形成双位点的结合模式，为通过本专利技术方法制备的趋化素功能活性体在炎症和脂肪调节中的应用提供了基础。
本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人源趋化素chemerin蛋白的功能活性体的重组制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的趋化素，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，通过同源重组进行构建，所述核苷酸序列的两端不涉及酶切位点。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述构建方法在氨基酸序列两端不涉及标签序列。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，接种量MOI值为1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，表达时间为96小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c中，趋化素功能活性体蛋白的提纯包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备的趋化素不包含多余氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备的趋化素可与趋化素受体形成双位点结合模式。
10.如权利要求1-9所述的制备重组人趋化素功能活性体蛋白的方法在趋化素抗炎解脂研发和工业生产中的应用。
...
【技术特征摘要】
1.一种人源趋化素chemerin蛋白的功能活性体的重组制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的趋化素，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，通过同源重组进行构建，所述核苷酸序列的两端不涉及酶切位点。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述构建方法在氨基酸序列两端不涉及标签序列。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，接种量moi值为1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱军，黄伟柱，
申请(专利权)人：东莞市松山湖中心医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。