【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合及其应用。
技术介绍
1、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，简称nsclc)是肺癌的一种主要类型，占肺癌病例的约80％，是全球发病率最高且死亡率最高的肿瘤之一。非小细胞肺癌是指起源于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞或其他肺部组织细胞的肺癌。nsclc包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等亚型，这些亚型在细胞形态、生长速度和对治疗的敏感性等方面存在差异。尽管nsclc占肺癌的大多数，但约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等，总之，非小细胞肺癌是一种复杂的疾病，涉及多种治疗手段和个体差异。随着医学研究的进展，针对nsclc的治疗选择越来越多，治疗效果也在不断提高。
2、met基因也称为c-met，为原癌基因，位于人类第7号染色体长臂7q21-31，dna长度约为125kb，包含21个外显子和20个内含子。met基因与多种肿瘤发生相关，在非小细胞肺癌(nsclc)中，met是一个重要的驱动基因。
3、met基因扩增是发生在nsclc中的一个关键分子变异，它指的是met基因拷贝数(gcn)的增加，主要有局部扩增和多倍体两种形式。局部扩增是指特定区域内met基因(有时包括其周围的基因区域)的拷贝数出现特异性增加，而染色体上的其他基因拷贝数则保持不变。多倍体则涉及更大规模的染色体变化，即整个染色体或其较大的一部分的拷贝数增加，在这种情况下，不仅仅是met基
4、met扩增在多种实体肿瘤中均有发现，可作为原发性肿瘤驱动基因变异之一。其中，nsclc中原发met扩增的发生率为1-5％，与不良预后相关。另一方面，met扩增更常继发于其他驱动基因(如egfr、alk)阳性的nsclc患者靶向治疗后，是egfr-tki和alk-tki耐药的重要机制之一。当egfr(或alk)信号通路被egfr-tki(或alk-tki)抑制时，作为旁路信号途径，继发性met扩增将绕过egfr(或alk)，激活下游通路，从而导致耐药发生。此外，met扩增水平和met抑制剂疗效呈正相关，即met扩增水平越高，使用met抑制剂效果越好。
5、随着met靶向药在国内上市，met抑制剂的可及性大大提高，晚期初治和egfr-tki或alk-tki等靶向药物耐药后的nsclc患者，应尽早进行相关检测，让更多met高倍扩增患者从靶向治疗中获益。
6、目前met基因扩增检测可通过荧光原位杂交(fish)、免疫组化(ihc)、二代测序(ngs)和微滴式数字pcr(ddpcr)这四种方法实现，每种方法均有其优缺点，①荧光原位杂交(fish)技术为检测met基因扩增的金标准，通过荧光标记的探针与细胞中的met基因序列进行特异性结合，直接在细胞核内显示基因的物理位置和拷贝数。通过计算肿瘤细胞中met基因拷贝数(gcn)以及met荧光信号与7号染色体着丝粒比值(met/cep7)，fish能够判断是否存在基因扩增。fish的优势在于其直观可视化基因拷贝数的能力，结果易于解读。缺点为判读标准缺乏全球统一标准，依赖人工判读，增加了结果的变异性。②免疫组化(ihc)法是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素等)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的方法。缺点是目前国内外检测met抗体的克隆号、染色性能均存在差异，尚没有统一的判读标准。需要更多的临床研究来证实met蛋白过表达的临床价值，进一步明确判读标准和获益阈值。③ngs技术通过高通量测序，能够对多个基因的序列变化进行分析。在met扩增的检测中，ngs利用测序深度和特定位点变异频率等信息计算met基因的拷贝数变异，并通过算法区分局部扩增和多体性扩增。缺点是不同实验室和商业检测在设计和数据分析策略上存在差异，导致检测结果的不一致性。④ddpcr是一种绝对定量的核酸分子检测技术，通过单个微滴中靶基因的扩增和荧光信号分析，直接计算靶基因的拷贝数，ddpcr的优势在于提供绝对定量的基因拷贝数检测，无需标准曲线或参照样本，在检测低丰度变异时具有高准确性；高灵敏度和特异性使其适合追踪微小残留疾病；操作简便且易于自动化，提高检测效率并降低操作误差。但是目前尚未有高效检测met基因扩增的ddpcr方法。
7、因此，提供一种基于微滴式数字pcr(ddpcr)技术进行met基因扩增检测的方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合及其应用。本专利技术采用微滴式数字pcr(ddpcr)技术，以组织、血浆中提取的dna为操作对象，进行met基因拷贝数检测，克服现有技术中met基因扩增检测中存在的不足，本专利技术的方法检测周期短，反应个数少，操作简便，检测结果灵敏度更高。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合，所述引物探针组合包括：扩增met基因的上下游引物，和特异性检测met基因的探针；
4、上游引物包括seq id no.1所示；下游引物包括seq id no.2所示；探针包括seqid no.3所示。
5、本专利技术检测范围为met基因全扩增，所以设计靶点覆盖met基因的2-3个外显子区域。
6、本专利技术筛选出的引物探针理论拷贝数与实际拷贝数线性关系良好，且扩增效率更高。
7、优选地，所述引物探针组合还包括：扩增ref基因的上下游引物，和特异性检测ref基因的探针；
8、上游引物包括seq id no.4所示；下游引物包括seq id no.5所示；探针包括seqid no.6所示。
9、ref基因为内参基因，本专利技术的内参基因选择人类管家基因上的片段，并进行大量验证，确保拷贝数稳定。
10、优选地，所述探针的5’端修饰荧光染料，所述探针的3’端修饰淬灭剂。
11、优选地，所述荧光染料选自：fam或vic。
12、优选地，所述淬灭剂选自：mgb或bhq1。
13、第二方面，本专利技术提供一种检测met基因扩增的数字pcr试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合。
14、优选地，所述试剂盒包括预混液和质控品。
15、优选地，所述预混液包括缓冲液、dna聚合酶和dntps。
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1.一种检测MET基因扩增的数字PCR引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：扩增MET基因的上下游引物，和特异性检测MET基因的探针；
2.根据权利要求1所述的检测MET基因扩增的数字PCR引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括：扩增REF基因的上下游引物，和特异性检测REF基因的探针；
3.根据权利要求1或2所述的检测MET基因扩增的数字PCR引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰荧光染料，所述探针的3’端修饰淬灭剂；
4.一种检测MET基因扩增的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的检测MET基因扩增的数字PCR引物探针组合。
5.根据权利要求4所述检测MET基因扩增的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预混液和质控品；
6.根据权利要求4或5所述检测MET基因扩增的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阴性质控和阳性质控；
7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测MET基因扩增的方法，其特征在于，所述方法包括：采集并提取DNA
8.根据权利要求7所述的检测MET基因扩增的方法，其特征在于，所述数字PCR扩增的程序包括：预变性：94-95℃，9-10min；变性：94-95℃，25-30秒；退火延伸：55-56℃，1-1.5min；仪器冷却：4-12℃，4-5min。
9.根据权利要求7或8所述的检测MET基因扩增的方法，其特征在于，所述检测结果的判断标准包括：根据2D散点图，划定FAM和VIC区域，以阴性液滴集中荧光值为基线；阳性阈值：FAM通道拷贝数/VIC通道拷贝数＞1.10即为阳性；阴性阈值：FAM通道拷贝数/VIC通道拷贝数≤1.10即为阴性。
10.权利要求1-3中任一项所述的检测MET基因扩增的数字PCR引物探针组合或权利要求4-6中任一项所述的检测MET基因扩增的数字PCR试剂盒在以非疾病诊断和/或治疗为目的的MET基因扩增检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：扩增met基因的上下游引物，和特异性检测met基因的探针；
2.根据权利要求1所述的检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括：扩增ref基因的上下游引物，和特异性检测ref基因的探针；
3.根据权利要求1或2所述的检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰荧光染料，所述探针的3’端修饰淬灭剂；
4.一种检测met基因扩增的数字pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的检测met基因扩增的数字pcr引物探针组合。
5.根据权利要求4所述检测met基因扩增的数字pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预混液和质控品；
6.根据权利要求4或5所述检测met基因扩增的数字pcr试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阴性质控和阳性质控；
7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测met基因扩增的方法，其特征在于，所述方法包括：...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛秋红，王洁，王方杰，葛如琴，于永娟，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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