【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌sers快速检测领域，具体涉及一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法。
技术介绍
1、细菌性脑膜炎是由于病原菌穿越血脑屏障侵入大脑皮层，引发颅内感染而产生的一种临床极其常见且十分严重的中枢神经系统炎症。在全球范围内每年造成近百万人死亡，急性致死率高达40％以上。婴幼儿由于其中枢系统功能和血脑屏障作用尚未发育完全，自身免疫能力较弱，极易受到各种条件致病菌侵袭，引发严重的颅内感染。临床统计数据显示，全球出生28天内因脑膜炎死亡的婴幼儿超过12600人，5岁以内婴幼儿因脑膜炎死亡总数超过91100例；且超过21％的婴幼儿可能遗留智力发育迟缓、运动发育落后等后遗症。其中，大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌是婴幼儿细菌性脑膜炎患者临床发病率最高的五种病原菌。中国及欧洲的细菌性脑膜炎临床实践指南中均明确提出，快速诊断及快速精准抗菌治疗是提高患者生存率改善患者预后的唯一途径。
2、细菌性脑膜炎的临床诊断一般以临床症状表现结合血液生化指标为参考，并没有明确的诊断依据，极易产生漏诊错诊；病原菌分析方法如聚合酶链式反应、宏基因组测序、流式细胞术等方法操作流程复杂、需要专业人员操作、检测周期一般需要20小时以上；脑脊液病原菌培养是细菌性脑膜炎鉴定的金标准，但一般需要二至数天的培养周期，且脑脊液培养的阳性率极低，现有方法均无法实现细菌性脑膜炎病原菌的快速检测。
3、sers技术可提供病原菌的指纹图谱信息，同时兼具图谱响应迅速、图谱信息丰富等优势，满足婴幼儿细菌性脑膜炎病原
技术实现思路
1、本专利技术的目的是要解决现有常见的细菌性脑膜炎病原菌的检测方法存在检测流程复杂、检测周期长、检测结果阳性率低，现有sers检测方法存在的盐溶液诱导粒子聚集效果不佳和sers检测数据质量差的问题，而提供一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法。
2、本专利技术提出了柠檬酸钠作为sers粒子在病原菌表面快速大量聚集的辅助分子，实验结果证明，柠檬酸根与钠离子共同作用协助au np在病原菌菌体表面快速大量紧密聚集，菌体表面产生丰富的sers热点增强区，成功在15min内实现了婴幼儿常见的细菌性脑膜炎五种病原菌的sers快速检测。
3、本专利技术通过预先制备病原菌检测用sers粒子胶体溶液，菌体表面快速形成sers热点区辅助液，利用低速离心机、拉曼光谱仪等简单仪器，仅通过离心、混合、sers检测等操作，在15min内即可实现婴幼儿常见的细菌性脑膜炎5种病原菌的现场sers快速检测。
4、一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，具体是按以下步骤完成的：
5、一、病原菌样品预处理：
6、①、将待检测的病原菌液体样品离心后去除上清液；
7、②、重复步骤一①1次～3次，并重悬在与步骤一①中去除的上清液等体积的超纯水中，得到预处理后的待检测的病原菌液体样品；
8、二、病原菌菌体表面快速形成丰富的sers热点区：
9、①、将浓度为0.01mg/ml～1mg/ml的氯金酸溶液加热至沸腾；在搅拌条件下，向沸腾的氯金酸溶液中加入浓度为1mg/ml～50mg/ml的柠檬酸钠溶液，继续搅拌并加热维持沸腾一段时间，冷却至室温，得到aunp胶体溶液；对aunp胶体溶液进行离心，去除上清后加入原溶液液体体积1/4的超纯水重悬，放入冰箱中4℃避光密封保存，得到病原菌检测用sers粒子胶体溶液；
10、②、配置柠檬酸钠溶液，放入冰箱中4℃避光密封保存，得到辅助液；
11、③、将预处理后的待检测的病原菌液体样品与病原菌检测用sers粒子胶体溶液混合，充分振荡至混合均匀，再加入辅助液，充分振荡至混合均匀，再静置，柠檬酸根与钠离子共同作用协助aunp粒子在菌体表面快速大量紧密聚集，即实现了待检测的病原菌菌体表面产生丰富的sers热点增强区，得到表面为sers热点区的病原菌；
12、三、制备病原菌sers检测样品：
13、将表面为sers热点区的病原菌进行离心，再去除上清液，再加入超纯水并混合均匀，得到表面为sers热点区的病原菌分散液；将表面为sers热点区的病原菌分散液滴加在单晶硅片上，再蒸干，得到病原菌sers检测样品；
14、四、使用拉曼光谱仪，采集病原菌的sers数据：
15、设置病原菌采集拉曼光谱参数为如下，激发光波长为785nm，积分时间为1～30s，平均次数为1～3次，每个病原菌sers检测样品采集5～50个样品点；如果采集到细菌性脑膜炎五种病原菌的sers特征峰，如563cm-1、663cm-1、734cm-1、892cm-1、928cm-1、960cm-1、1002cm-1、1030cm-1、1126cm-1、1243cm-1、1267cm-1、1319cm-1、1470cm-1、1575cm-1、1582cm-1、1597cm-1，说明待检测的病原菌液体样品中含有细菌性脑膜炎病原菌；即完成一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法。
16、本专利技术的优点：
17、一、本专利技术提供了一种病原菌菌体表面快速产生丰富sers热点增强区的新方法；通过病原菌样品预处理流程去除病原菌生长代谢产生的sers探测干扰物，将预先制备的sers粒子胶体溶液、菌体表面快速形成sers热点区辅助液与待检测病原菌混合，静置3min即可实现病原菌菌体表面sers粒子大量紧密富集，进而产生丰富的sers热点区；
18、二、本专利技术提供了一种细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测新方法；通过实验研究首次提出了柠檬酸根与钠离子共同协助aunp粒子在病原菌菌体表面快速大量紧密富集，仅通过离心、混匀、静置等简单操作，利用低速离心机、拉曼光谱仪等小型仪器设备，成功在15min内实现了婴幼儿常见的五种病原菌的sers现场快速检测；
19、三、本专利技术提供的细菌性脑膜炎病原菌sers快速检测方法，不仅可用于婴幼儿细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测，也可用于临床细菌感染病原菌分析、食品中条件致病菌分析、无菌实验室等场景中的病原菌的现场快速检测。
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1.一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于所述方法具体是按以下步骤完成的：
2.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤一①中所述的待检测的病原菌为大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌中的一种或几种；步骤一①中将0.1mL～3mLOD值为0.08～0.2的待检测的病原菌液体样品装载到离心管中，再进行离心，离心的转速为2000rpm～6000rpm，离心的时间为1min～10min。
3.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤一②中重复步骤一①1次的方法为：加入与步骤一①中去除的上清液等体积的超纯水，充分振荡至病原菌分散均匀，再进行离心，离心的转速为2000rpm/min～6000rpm/min，离心的时间为1min～10min。
4.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤二①中所述的浓度为0.01mg/mL～1mg/mL的氯金酸溶液与浓度为1mg/mL～5
5.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤二①中所述的搅拌的速度为700rpm～1100rpm；步骤二①中继续搅拌并加热维持沸腾30min～40min。
6.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤二①中所述的离心的速度为6000rpm～12000rpm；步骤二②中所述的柠檬酸钠溶液的浓度为50mmol/L～1000mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤二③中所述的预处理后的待检测的病原菌液体样品与病原菌检测用SERS粒子胶体溶液的体积比为(0.1mL～1mL):(0.1mL～1mL)；步骤二③中所述的预处理后的待检测的病原菌液体样品与辅助液的体积比为(0.1mL～1mL):(10μL～200μL)；步骤二③中所述的静置的时间为1min～10min。
8.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤三中所述的离心的速度为2000rpm～6000rpm，离心的时间为1min～10min；步骤三中所述的超纯水与步骤二③中所述的预处理后的待检测的病原菌液体样品的体积比为(0.1mL～1mL):(0.1mL～1mL)。
9.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤三中将0.01mL～1mL表面为SERS热点区的病原菌分散液滴加在厚度为100μm～1000μm的单晶硅片上，再自然蒸干，得到病原菌SERS检测样品。
10.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的SERS快速检测方法，其特征在于步骤四中根据SERS特征峰的峰位归属，即可实现细菌性脑膜炎病原菌的分型；
...【技术特征摘要】
1.一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，其特征在于所述方法具体是按以下步骤完成的：
2.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，其特征在于步骤一①中所述的待检测的病原菌为大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎链球菌中的一种或几种；步骤一①中将0.1ml～3mlod值为0.08～0.2的待检测的病原菌液体样品装载到离心管中，再进行离心，离心的转速为2000rpm～6000rpm，离心的时间为1min～10min。
3.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，其特征在于步骤一②中重复步骤一①1次的方法为：加入与步骤一①中去除的上清液等体积的超纯水，充分振荡至病原菌分散均匀，再进行离心，离心的转速为2000rpm/min～6000rpm/min，离心的时间为1min～10min。
4.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，其特征在于步骤二①中所述的浓度为0.01mg/ml～1mg/ml的氯金酸溶液与浓度为1mg/ml～50mg/ml的柠檬酸钠的体积比为(50ml～100ml):(3ml～8ml)。
5.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性脑膜炎病原菌的sers快速检测方法，其特征在于步骤二①中所述的搅拌的速度为700rpm～1100rpm；步骤二①中继续搅拌并加热维持沸腾30min～40min。
6.根据权利要求1所述的一种液体中细菌性...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晔，张成刚，于淼，赵子政，刘雨锜，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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