【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及巴戟天多糖制备，具体为一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法。
技术介绍
1、现有缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法与应用在实际使用过程中还存在以下问题：目前人们采用超声提取法和酶解法来实现对巴戟天多糖的提取，超声提取法是通过超声波产生的空化效应增加溶剂穿透力，除此提取步骤之外，巴戟天多糖还需进行蛋白质的去除、色素的去除、透析法、沉淀法以及柱层析法等分离纯化操作，然而，上述巴戟天多糖的提取方法的提取率仍然较低，而且要么耗时长，要么产量低，要么成本高；巴戟天多糖的结构研究侧重于单糖组成、侧链位置等，对于高级结构、构效关系等研究较少，不同提取方法所得的多糖组成及分子量分布有很大差异，无法满足市场需求，也不利于巴戟天多糖在营养领域的推广与应用
2、所以我们提出了一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，以便于解决上述中提出的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，为解决目前针对巴戟天多糖提取方法的提取率仍然较低，而且要么耗时长，要么产量低，要么成本高；巴戟天多糖的结构研究侧重于单糖组成、侧链位置等，对于高级结构、构效关系等研究较少，不同提取方法所得的多糖组成及分子量分布有很大差异，无法满足市场需求，也不利于巴戟天多糖在营养领域的推广与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，包括以下操作步骤：
3、包括以下操作步骤：
4、s1：巴戟天多
5、制备所需的材料准备：洗净后切片干燥的巴戟天根、超纯水、破碎机、无水乙醇、超声波提取器、旋转蒸发仪、真空冷冻干燥机以及干燥存储罐；
6、s2：巴戟天多糖粗提的方法；
7、s21：将巴戟天根洗净后切片干燥，用破碎机将其研磨成粉末备用，巴戟天粉末和超纯水按1:60比例充分混匀；
8、s22：在超声环境下浸提，随后转入90℃环境下反应3小时，将反应液离心，取上清液浓缩后加入一定量无水乙醇，使溶液中乙醇的终体积分数为80%，置于4℃中静置24h；
9、s23：过夜沉淀后反应液离心，保留沉淀得到巴戟天粗多糖；
10、s24：并利用旋转蒸发仪除去粗多糖残留的有机溶剂，最后将粗多糖放入真空冷冻干燥机冻干24h，放入干燥罐中保存；
11、s3：巴戟天多糖的纯化；
12、s31：先用sevage法除去巴戟天粗多糖中的蛋白质，配制一定浓度的广佛手粗多糖溶液和sevage溶液（氯仿：正丁醇=4:1），向巴戟天多糖溶液加入其体积1/4的sevage溶液充分混匀30min-60min后离心，上清溶液为多糖，中间层为蛋白质，下层溶液为有机溶剂；
13、s32：吸取上清后重复上述步骤，直至没有中间层，剩余有机溶剂倒入分液漏斗中静置过夜后方可重复利用；
14、s33：除净蛋白质后的巴戟天多糖溶液倒入旋转蒸发仪的茄形瓶中，40℃真空蒸发出样液中的有机溶剂；
15、s34：利用透析袋将多糖中的小分子物质和盐分析出，得到较纯净的巴戟天多糖；
16、s4：巴戟天多糖的分离；
17、s41：将事先活化好的deae-葡聚糖凝胶a-25装填于柱子中，平衡一段时间后，将特定浓度的巴戟天粗多糖溶液缓慢加到凝胶柱上；
18、s42：打开恒流泵，设置流速，用部分收集器收集洗脱液，每三分钟收集一管，流动相离子特定浓度的nacl溶液，并隔管洗脱液用苯酚-硫酸法测定多糖含量；
19、s43：以管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到多糖的洗脱曲线，分析洗脱曲线数据后根据峰值和洗脱液浓度划分纯化组分，对应同一纯化组分的管；
20、s44：冷冻干燥得到组分fcp-d1，而后使用葡聚糖凝胶g-200柱纯化，得到组分fcp-g1。
21、一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，细胞的培养与分化：利用c2c12成肌细胞开展体外实验，c2c12细胞采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的dmem培养基，37℃，5%co2培养箱中培养，细胞生长至80%左右，用含有2%马血清、1%青霉素-链霉素溶液的dmem培养基诱导肌管分化，每天更换培养基，连续诱导5d至肌管形成。
22、优选的，所述肌萎缩模型诱导与分组：c2c12细胞分化成功后，使用10um地塞米松溶液诱导细胞24小时建立肌萎缩模型，并分为6组：对照组、地塞米松组、地塞米松＋10ug/ml巴戟天多糖组、地塞米松＋25ug/ml巴戟天多糖组、地塞米松＋50ug/ml巴戟天多糖组和地塞米松＋100ug/ml巴戟天多糖组。
23、优选的，所述巴戟天多糖干预：使用提纯后的巴戟天多糖以不同浓度梯度干预细胞24小时。
24、优选的，所述指标检测：观察c2c12肌管形态；检测肌管细胞内的atp水平，检测sirt1、myhc、foxo3、murf1和atrogin-1基因mrna和蛋白水平的变化。
25、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，巴戟天多糖为缓解肌萎缩的药物治疗提供新思路，为巴戟天多糖在营养补剂市场的应用提供技术支持，使用纯化后结构清晰的巴戟天多糖，证实了巴戟天多糖在肌萎缩中的应用，其具体内容如下：
26、1.巴戟天多糖（mop）可显著预防和减轻地塞米松诱导的成肌细胞纤维萎缩，相对于地塞米松诱导组，巴戟天多糖干预组中c2c12细胞肌管直径有增粗趋势；
27、在加入地塞米松的情况下（10um）不同浓度巴戟天多糖（10ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml）对c2c12成肌细胞肌管直径的影响；ctl组：空白对照组，不加巴戟天多糖和地塞米松；dex组：地塞米松诱导组，10um；mop1（10ug/ml）组：mop（10ug/ml）+dex（10um）；mop1（25ug/ml）组：mop（25ug/ml）+dex（10um）；mop1（50ug/ml）组：mop（50ug/ml）+dex（10um）；mop1（100ug/ml）组：mop（100ug/ml）+dex（10um），*表示两组间存在显著性差异（p<0.05）。
28、2.巴戟天多糖（mop）可改善由地塞米松引起的肌细胞线粒体atp代谢水平下降，相对于地塞米松诱导组，巴戟天多糖干预组中c2c12细胞内atp含量有升高趋势；
29、在加入地塞米松的情况下（10um）不同浓度巴戟天多糖（10ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml）对c2c12成肌细胞中atp产生的影响。ctl：空白对照组，不加巴戟天多糖和地塞米松；dex：地塞米松诱导组，10um；mop（10ug/ml）组：mop（10ug/ml）+dex（10um）；mop1（25ug/ml）组：mop（25ug/ml）+dex（10um）；mop1（50ug/ml）组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
2.一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，其特征在于：细胞的培养与分化：利用C2C12成肌细胞开展体外实验，C2C12细胞采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞生长至80%左右，用含有2%马血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基诱导肌管分化，每天更换培养基，连续诱导5d至肌管形成。
3.根据权利要求2所述的一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，其特征在于，肌萎缩模型诱导与分组：C2C12细胞分化成功后，使用10uM地塞米松溶液诱导细胞24小时建立肌萎缩模型，并分为6组：对照组、地塞米松组、地塞米松＋10ug/ml巴戟天多糖组、地塞米松＋25ug/ml巴戟天多糖组、地塞米松＋50ug/ml巴戟天多糖组和地塞米松＋100ug/ml巴戟天多糖组。
4.根据权利要求2所述的一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，其特征在于，巴戟天多糖干预：使用提纯后的巴戟天多糖以不同浓度梯度干预细胞24小时。
<...【技术特征摘要】
1.一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
2.一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，其特征在于：细胞的培养与分化：利用c2c12成肌细胞开展体外实验，c2c12细胞采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的dmem培养基，37℃，5%co2培养箱中培养，细胞生长至80%左右，用含有2%马血清、1%青霉素-链霉素溶液的dmem培养基诱导肌管分化，每天更换培养基，连续诱导5d至肌管形成。
3.根据权利要求2所述的一种缓解肌萎缩的巴戟天多糖的体外应用实验，其特征在于，肌萎缩模型诱导与分组：c2c12细胞分化成功后，使用10um地塞米松溶液诱导细胞24小...
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