【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法及装置。
技术介绍
1、现有检测微卫星不稳定（micro-satellite instability，msi）的技术主要使用pcr方法判断样本msi状态，是当前msi检测的金标准。该方法使用荧光标记引物和毛细管电泳确定nr-21、nr-24、bat-25、bat-26和mono-27这五个微卫星位点的片段长度多态性。通过对比肿瘤组织与正常对照样本在这五个微卫星位点上的多态性，可以确认位点是否存在不稳定的情况。若五个微卫星位点中有两个或以上出现微卫星不稳定，则判定为微卫星高度不稳定（msi-high，msi-h），否则为微卫星低度不稳定（msi-low，msi-l）或微卫星稳定（micro-satellite stable，mss）。
2、除pcr外，基于杂交捕获和扩增子的二代测序进行msi检测的方法发展迅速，已有多种方法和工具发表并应用于临床检测和科学研究上。但都具有其各自的不足和缺陷，具体地：
3、1）pcr检测是当前msi检测的金标准，准确性高，但对于样本的要求较高。使用pcr需要同时对肿瘤组织样本和对照样本进行检测，而且对肿瘤组织样本的纯度具有一定的要求。
4、2）基于二代测序技术的msi检测，对于肿瘤纯度的要求低、不需要对照样本。这些方法能够同时进行进行微卫星不稳定检测和其他的检测，但结果的准确性仍待提高。
5、此外，因为杂交捕获和扩增子测序差异化的数据特性，目前尚未有能够同时用于杂交捕获和扩增子测序
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。
2、为此，本专利技术的目的在于提供一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法及装置，具有高稳定性、高准确性，且无需对照样本，能够同时应用于杂交捕获和扩增子测序数据的微卫星不稳定检测。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术是这样实现的：
4、本专利技术实施例提供了一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，所述方法包括：
5、选取一组重复序列长度均在10-15bp之间的msi位点，基于所述msi位点的任意组合进行捕获探针设计和/或扩增子引物；
6、选取若干样本，对每个样本，计算其在每个msi位点的deletion ratio（缺失片段比例）和reference ratio（正常片段比例）；
7、从上述样本中选取若干个被pcr法判断为msi-l或mss状态的样本作为基线样本，对每个所述基线样本设置不同的深度水平，基于各深度水平构建基线；
8、基于构建的基线，对选取的各样本进行msi状态检测；
9、选出msi状态检测结果为msi-h的样本，通过计算spearman秩相关系数判断其是否为异常样本；当判断为异常样本时，对该样本的基线进行调整并重新判断msi状态。
10、另外，根据本专利技术的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，还可以具有如下附加的技术特征：
11、在其中的一些实施方式中，计算样本的缺失片段比例和正常片段比例的内容包括：
12、a）将测序得到的碱基序列比对到人类基因组参考序列上，提取完全覆盖msi位点所在区域及两翼至少各两个碱基长度的测序碱基序列；
13、b）对捕获测序样本的测序数据进行过滤；
14、c）对捕获测序样本过滤后的测序碱基序列进行去重；
15、d）针对剩余的每条测序碱基序列，统计各自在当前msi位点的重复序列长度，根据测序碱基序列的重复序列长度与人类基因组参考序列的相对关系，对测序碱基序列进行分类；统计各类别的测序碱基序列数量和测序碱基序列总数量，计算得到缺失片段比例和正常片段比例。
16、在其中的一些实施方式中，对捕获测序样本的测序数据进行过滤的内容包括：
17、提取出每条测序碱基序列上对应msi位点两翼各三个碱基长度的序列；对于msi位点两翼在read边缘覆盖不足三个碱基的，只提取两个碱基；若测序碱基序列在这些位置的碱基序列与人类基因组参考序列不完全一致，过滤掉该测序碱基序列；
18、提取出每条测序碱基序列上对应msi位点区域的序列；若该段序列中有大于等于两个碱基与参考序列不一致，过滤该测序碱基序列；若该段序列中有一个碱基与人类基因组参考序列不一致且该序列恰好在msi位点的起始或终止位置的，过滤掉该测序碱基序列。
19、在其中的一些实施方式中，对捕获测序样本过滤后的测序碱基序列进行去重的内容包括：
20、对捕获测序的样本，按照每条测序碱基序列的起始和终止位点，判断测序碱基序列的dna原始分子片段来源；测序碱基序列为单端测序碱基序列或双端测序碱基序列；
21、对于来源于同一dna原始分子片段的重复测序碱基序列，随机从重复测序碱基序列中抽取一条进行保留。
22、在其中的一些实施方式中，构建基线的过程包括：
23、a）计算每一基线样本在各msi位点的相应深度水平下的缺失片段比例和正常片段比例；
24、b）计算每个msi位点在其深度水平下的基线；其包括：
25、计算每个msi位点在其基线样本中缺失片段比例的基线均值和标准差；
26、计算每个msi位点在其基线样本中正常片段比例的基线均值和标准差。
27、在其中的一些实施方式中，基于构建的基线，对选取的各样本进行msi状态检测的内容包括：
28、a）计算各样本在每个msi位点上的缺失片段比例和正常片段比例；
29、b）计算每个msi位点的深度，根据该深度匹配同等深度水平的基线；
30、c）计算样本在每个msi位点上的缺失片段比例和正常片段比例相对于基线的z_score；
31、d）根据计算得到的深度和z_score，对样本在各msi位点的状态进行判定；
32、判定结果为位点质控不合格、位点不稳定或位点稳定；
33、e）综合所有msi位点的状态，计算msi score并统计质控合格位点的数量，根据统计结果对样本的msi状态进行判定。
34、在其中的一些实施方式中，spearman秩相关系数为缺失片段比例和基线缺失片段比例均值的spearman秩相关系数；
35、设定spearman秩相关系数的异常阈值，当spearman秩相关系数大于等于异常阈值时，判断相应样本为异常样本；否则，判断相应样本正常。
36、在其中的一些实施方式中，重复序列长度均在10-15bp之间的msi位点的数量为74。
37、在其中的一些实施方式中，对异常样本的基线进行调整并重新判断msi状态的内容包括：对该样本在每个位点上匹配到的基线进行调整，并根据调整后基线重新进行位点状态的判断，综合所有位点的判断结果，得到该样本新的msi状态，用该ms本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，计算样本的缺失片段比例和正常片段比例的内容包括：
3.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，对捕获测序样本的测序数据进行过滤的内容包括：
4.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，对捕获测序样本过滤后的测序碱基序列进行去重的内容包括：
5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，构建基线的过程包括：
6.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，基于构建的基线，对选取的各样本进行MSI状态检测的内容包括：
7.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，Spearman秩相关系数为缺失片段比例和基线缺失片段比例均值的Spearman秩相关系数；
8.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星
9.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，对异常样本的基线进行调整并重新判断MSI状态的内容包括：对该样本在每个位点上匹配到的基线进行调整，并根据调整后基线重新进行位点状态的判断，综合所有位点的判断结果，得到该样本新的MSI状态，用该MSI状态替换原MSI状态。
10.一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测装置，包括处理器和存储器，所述存储器上存储有软件程序，其特征在于，当所述处理器运行所述软件程序时能够实现如权利要求1至9中任意一项所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法的内容。
...【技术特征摘要】
1.一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，计算样本的缺失片段比例和正常片段比例的内容包括：
3.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，对捕获测序样本的测序数据进行过滤的内容包括：
4.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，对捕获测序样本过滤后的测序碱基序列进行去重的内容包括：
5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，构建基线的过程包括：
6.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，基于构建的基线，对选取的各样本进行msi状态检测的内容包括：
7.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩天澄，黄宇，陈维之，杜波，
申请(专利权)人：臻和北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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