【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水稻基因育种，尤其涉及沉默或敲除水稻cslf6基因在水稻育种调控中降低水稻籽粒中cd积累的应用。
技术介绍
1、水稻具有较强的cd吸收能力，cd污染不仅导致水稻减产，而且会在稻米中积累，通过食物链进入人体，威胁人体健康。cd进入人体后在肾脏积累，危害骨骼和呼吸系统并引发一系列疾病。世界卫生组织已将cd划为一级致癌物质。因此通过转基因技术改良水稻抗重金属胁迫，以减少水稻中重金属的积累，对改善耕田生态环境，实现农业生态和粮食生产的可持续发展具有重要意义。
2、植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和少量蛋白质等组成的一个复合体。作为重金属离子进入植物细胞的第一道屏障，不仅起着支撑和保护细胞的作用，同时也是响应重金属胁迫的功能信号所在的位点，在植物遭受逆境胁迫时第一时间感知并启动下游胁迫响应，对cd的积累和转运具有重要作用。细胞壁能将重金属离子隔离在胞外，主动参与植物对重金属胁迫的响应过程，进而降低进入原生质体的重金属离子数量。类纤维素合酶cslf(cellulose synthase-like f)是参与纤维素的合成的重要酶，从而影响植物细胞壁的构成。
3、cslf6是植物体内一类重要的基因，属于植物细胞壁合成酶家族中的一员。纤维素合酶cesa与类纤维素合酶cslf是纤维素合成过程中的关键酶，cslf6基因编码的酶负责合成(1,3；1,4)-β-葡聚糖，这是一种混合链葡聚糖(mlg)，在谷物如小麦、大麦和水稻中含量较高。这种多糖因其在水中的高溶解性而被认为是一种有价值的膳食纤维。通过研
技术实现思路
1、为了减少重金属在水稻籽粒中的累积，本专利技术提供了沉默或敲除水稻cslf6基因在水稻育种调控中降低水稻籽粒中cd积累的应用该应用可以减少重金属在水稻籽粒中的累积，这对培育新的水稻品种具有重要的意义。
2、为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：
3、沉默或敲除水稻cslf6基因在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累；所述的水稻cslf6基因的cds区核苷酸序列如seq id no:1所示。
4、作为优选，敲除水稻cslf6基因为cslf6 j123-2缺失了44个碱基或cslf6 j123-8插入了1个碱基。
5、作为优选，述的敲除是通过crispr/cas9方法靶向沉默或敲除所述水稻cslf6基因，获得敲除突变体植株。
6、作为优选，通过cslf crispr进行载体的构建，靶点测序结果统计如下：
7、
8、
9、作为优选，本专利技术采用以下的靶标：cslf crispr载体构建的靶标为：
10、靶标1：gcgtatcgagcacaagaacccgg，
11、靶标2：tgggatgctcctcacctacgagg。
12、进一步，本专利技术还公开了不表达或降低表达水稻cslf6基因编码的蛋白在在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累；所述的水稻cslf6基因的cds区核苷酸序列如seq id no:1所示；编码的蛋白质的氨基酸序列如序列seq id no.2所示。
13、进一步，本专利技术还公开了包含所述的沉默或敲除水稻cslf6基因的转化载体在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累；所述的水稻cslf6基因的cds区核苷酸序列如seq id no:1所示。
14、进一步，本专利技术还公开了包含所述的转化载体的宿主细胞在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累。
15、进一步，本专利技术还公开了一种降低水稻籽粒中cd积累的育种方法，该方法包括将水稻中水稻cslf6基因沉默或敲除的步骤，获得降低水稻籽粒中cd积累水稻株系；所述的水稻cslf6基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
16、进一步，本专利技术还公开了一种降低水稻籽粒中cd积累的育种方法，该方法包括通过筛选水稻cslf6基因编码的蛋白无表达量或表达量低的水稻植株获得降低水稻籽粒中cd积累水稻株系；所述的水稻cslf6基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
17、作为优选，该方法包括以下的步骤：
18、1)从水稻中提取dna，并通过pcr扩增得到敲除水稻cslf6基因的编码序列；
19、2)将pcr扩增的敲除水稻cslf6基因片段通过限制性内切酶切割后插入植物表达载体中；
20、3)选择适合基因转化的水稻品种，将构建好的载体转入农杆菌，在适宜条件下培养农杆菌菌株；
21、4)对水稻种子进行表面消毒，然后在诱导培养基中培养形成胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织与农杆菌混合，进行共培养；
22、5)用含抗生素的培养基筛选转化的愈伤组织，以去除未转化的细胞；
23、6)将筛选后的愈伤组织转入再生培养基，诱导形成完整的水稻植株。
24、本专利技术通过沉默或敲除水稻cslf6基因，可以降低水稻对cd的吸收效率，从而减少水稻籽粒中的cd含量。这一策略有助于开发出更安全的水稻品种，满足重金属污染地区对低镉水稻的需求。进一步，本专利技术crispr/cas9系统被用于靶向沉默或敲除水稻cslf6基因，构建了特定的crispr载体(cslf crispr)，以实现cslf6基因的沉默。选择的靶点序列精确对应于cslf6基因的cds区，通过编辑这些靶点，获得了敲除突变体植株，进一步用于低cd积累水稻的选育。
25、此外，使用不表达或低表达cslf6基因编码蛋白的水稻株系，通过分子筛选和表型鉴定，成功获得了低cd积累的水稻株系。通过重组cslf6基因相关的转化载体，将其转入水稻宿主细胞，能够有效减少cd在水稻籽粒中的累积，这种基因调控方式为水稻育种带来了新的技术途径，尤其适用于受cd污染的地区，为低cd水稻品种的培育提供了可行的策略。
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1.沉默或敲除水稻CSLF6基因在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中Cd积累；所述的水稻CSLF6基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除水稻CSLF6基因为CSLF6 J123-2缺失了44个碱基或CSLF6 J123-8插入了1个碱基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的敲除是通过CRISPR/Cas9方法靶向沉默或敲除所述水稻CSLF6基因，获得敲除突变体植株。
4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过EXP CRISPR或CSLF CRISPR进行载体的构建，其中：
5.不表达或降低表达水稻CSLF6基因编码的蛋白在在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中Cd积累；所述的水稻CSLF6基因的CDS区核苷酸序列如SEQ IDNo: 1所示；编码的蛋白质的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.2所示。
6.包含权利要求1所述的沉默或敲除水稻CSLF6基因的转化载体在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调
7.包含权利要求6所述的转化载体的宿主细胞在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中Cd积累。
8.一种降低水稻籽粒中Cd积累的育种方法，其特征在于，该方法包括将水稻中水稻CSLF6基因沉默或敲除的步骤，获得降低水稻籽粒中Cd积累水稻株系；所述的水稻CSLF6基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
9.一种降低水稻籽粒中Cd积累的育种方法，其特征在于，该方法包括通过筛选水稻CSLF6基因编码的蛋白无表达量或表达量低的水稻植株获得降低水稻籽粒中Cd积累水稻株系；所述的水稻CSLF6基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
...【技术特征摘要】
1.沉默或敲除水稻cslf6基因在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累；所述的水稻cslf6基因的cds区核苷酸序列如seq id no: 1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除水稻cslf6基因为cslf6 j123-2缺失了44个碱基或cslf6 j123-8插入了1个碱基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的敲除是通过crispr/cas9方法靶向沉默或敲除所述水稻cslf6基因，获得敲除突变体植株。
4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过exp crispr或cslf crispr进行载体的构建，其中：
5.不表达或降低表达水稻cslf6基因编码的蛋白在在水稻育种调控中的应用，所述水稻育种调控为降低水稻籽粒中cd积累；所述的水稻cslf6基因的cds区核苷酸序列如seq idno: 1所示；编码的蛋白质的氨基酸序列如序列seq id no.2所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：丁艳菲，朱诚，程卓玮，王飞娟，张雷蕾，贺希格都楞，唐凡，江琼，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：
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