【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工业微生物，具体涉及一种高效生产甘氨酸的工程菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、甘氨酸又称氨基乙酸，是最重要的基础氨基酸之一，广泛应用于农药、医药、食品、饲料及化妆品等领域。在农药领域，甘氨酸可用于生产有机磷类除草剂草甘膦，也可用于制备植物生长调节剂(如增甘膦)。在医药领域，甘氨酸可用于合成降血压药(如盐酸地拉普利)和胃药(如碳酸钙制剂)。在食品领域，甘氨酸可用作食品防腐剂，有效延长食品保质期，也可用作调味剂，提升食品风味。在饲料领域，甘氨酸主要用作鸡、牛和羊饲料的添加剂，其不仅可为动物提供重要营养物质，而且能够防止饲料氧化变质，从而延长饲料保存期。在日化领域，甘氨酸可用作皮肤调理剂，其衍生物辛酰甘氨酸在化妆品中作保湿剂、清洁剂以及表面活性剂使用且具有抑菌效果，以甘氨酸为原料合成的氨基酸表面活性剂椰油酰甘氨酸钠、椰油酰甘氨酸钾广泛的用于洁面和沐浴产品中。近年来，随着绿色可持续发展理念的深入，消费者更加关注日化和食品等领域原料的绿色来源。传统甘氨酸合成工艺主要采用石化来源的原料，为了更加符合绿色发展的大趋势，开发天然来源原料产甘氨酸的方法具有重要的现实意义。
2、传统甘氨酸的合成方法主要包括3种，分别为蛋白质水解法、化学合成法和生物合成法。蛋白质水解法是工业领域早期用于制备甘氨酸的方法，由于原料受限，该方法已经基本被淘汰。目前甘氨酸的获取主要通过化学合成法和生物合成法。化学合成法主要包括氯乙酸氨解法、施特雷克法、氨基乙腈法、直接海因法、醇氨氧化法和羟基乙酸甲酯法等。生物合成法包括以乙醇胺为底物，在好氧
3、大肠杆菌作为遗传背景清晰、遗传操作简单的模式微生物，常被用来进行代谢工程改造以生产具有高附加值的代谢产物。在大肠杆菌中甘氨酸可以由丝氨酸、苏氨酸等前体物质得到，但鲜有以葡萄糖为底物通过代谢工程改造合成甘氨酸的研究。基于以上，提供一种能够高效发酵生产甘氨酸的菌株及其构建方法对提高甘氨酸的产量、降低生产成本及开发天然来源原料具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有甘氨酸合成技术采用石化来源原料，或天然来源原料但产量/转化率较低的问题，本研究目的是：提供一种高效生产甘氨酸的工程菌株及其构建方法和应用，通过对甘氨酸生物合成代谢通路的改造，构建能够高效合成甘氨酸的工程菌株，能够以葡萄糖为碳源发酵产甘氨酸且具有较高的转化率。
2、为此，本专利技术提供如下技术方案。
3、本专利技术的第一个方面提供了一种生产甘氨酸的工程菌株，所述工程菌株是经过如下修饰得到：
4、(i)分别引入外源乙酰辅酶a合成酶基因acs、异柠檬酸裂解酶基因acea和异柠檬酸脱氢酶激酶基因acek；
5、(ii)引入来源于藜麦的谷氨酸乙醛酸转氨酶基因cgat；
6、(iii)分别敲除dna结合转录抑制因子基因iclr、甘氨酸脱氢酶基因gcvp、丙氨酸转氨酶基因alaa、苹果酸脱氢酶基因maea、苹果酸合成酶g基因glcb。
7、本专利技术的第一个方面提供了一种生产甘氨酸的工程菌株的构建方法，所述方法构建方法包括：
8、构建宿主菌株：用乙酰辅酶a合成酶基因acs替换大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因poxb，用异柠檬酸裂解酶基因acea和异柠檬酸脱氢酶激酶基因acek替换大肠杆菌基因组中的苹果酸合成酶基因aceb；
9、敲除dna结合转录抑制因子基因iclr、甘氨酸脱氢酶基因gcvp、丙氨酸转氨酶基因alaa、苹果酸脱氢酶基因maea、苹果酸合成酶g基因glcb，得到突变型大肠杆菌hg07；
10、构建重组载体：将外源谷氨酸乙醛酸转氨酶基因cgat插入至质粒prb1k的ncoi和ecori位点间，得到重组载体pg01；
11、构建工程菌株：将上述重组载体pg01导入上述突变型大肠杆菌hg07中，即得到重组工程菌株sg0701。
12、本专利技术的第三个方面提供了一种如前所述的工程菌株在制备甘氨酸中的应用。
13、本专利技术的第四个方面提供了一种根据如前所述的工程菌株制备甘氨酸的方法，所述方法包括：
14、s1：菌株的扩培和诱导：将重组工程菌株sg0701接种至含有卡那霉素的lb固体平板上，放置于37℃培养箱培养12-16h，挑取单菌落接种到含有卡那霉素lb液体培养基中进行扩培，随后按0.5-2％体积比转接于含卡那霉素的zym自诱导培养基中自诱导培养过夜，最后测定od600光吸收值，并收集3×1010-4×1010/ml菌体；
15、s2：全细胞催化转化：将上述收集的菌体离心，用生理盐水洗菌，弃上清后，将所得菌体重悬，得到终浓度为3×1010-4×1010/ml的菌悬液；
16、将上述菌悬液与50-80mm的葡萄糖、40-64mm nh4cl、2-4mm mgso4、10-15mm谷氨酸钠和1×m9 salts混合进行转化反应，得到甘氨酸。
17、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤s1中，所述扩培条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm，时间8-12h。
18、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤s1中，所述自诱导培养条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm。
19、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤s2中，所述离心条件为：温度4-15℃，转速4000-6000rpm，时间5-10min。
20、在本专利技术的一个优选实施例中，步骤s2中，所述转化反应条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm，时间2～24h。
21、在本专利技术的一个优选实施例中，所述卡那霉素含量为50μg/ml。
22、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点：
23、与传统甘氨酸合成方法比较，本专利技术使用的原料为可持续碳源葡萄糖，更符合绿色可持续的大趋势，其天然来源指数可达100％，而石化原料合成的甘氨酸天然来源指数为0。本专利技术所采用的生物法生产甘氨酸工艺替代了传统的化学工艺，以可再生的绿色原料替代了不可再生的石化原料，进一步降低了生产成本，生产过程更加绿色环保，市场竞争优势明显。与已报道发酵产甘氨酸工艺相比，本专利技术的菌种具有转化率高(0.33g/g)的优势，更具有产业化前景。
24、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。
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1.一种生产甘氨酸的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株是经过如下修饰得到：
2.根据权利要求1所述的生产甘氨酸的工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法构建方法包括：
3.根据权利要求1所述的工程菌株在制备甘氨酸中的应用。
4.根据权利要求1所述的工程菌株制备甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述扩培条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm，时间8-12h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述自诱导培养条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心条件为：温度4-15℃，转速4000-6000rpm，时间5-10min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述转化反应条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm，时间2～24h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述卡那霉素含量为50μg
...【技术特征摘要】
1.一种生产甘氨酸的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株是经过如下修饰得到：
2.根据权利要求1所述的生产甘氨酸的工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法构建方法包括：
3.根据权利要求1所述的工程菌株在制备甘氨酸中的应用。
4.根据权利要求1所述的工程菌株制备甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述扩培条件为：温度25-42℃，转速100-300rpm，时间8-12h。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵苏琴，孔聪聪，卢燕东，苏桂珍，
申请(专利权)人：南京华狮新材料有限公司，
类型：发明
国别省市：
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