【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感器检测，尤其涉及基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
1、atp(三磷酸腺苷)检测是一种用于评估生物活性、卫生状况、细胞活力和代谢活动的方法。atp是生物体内能量的通用货币，几乎所有生命形式都依赖atp作为能量载体。在不同的应用中，atp检测可以采取多种方式：如生物发光测定法、比色法和荧光法和高效液相色谱法等(hplc)；
2、在采用生物发光测定法中，由于生物传感器的灵敏度较高，因此容易受到样品中其他物质的干扰，并且检测的设备成本较高；在比色法和荧光法中，由于生物传感器的灵敏度较低，样品的颜色或荧光容易受到其他化合物的干扰，可能导致测量不准确，在高效液相色谱法(hplc)中，样品送入检测仪器到获得检测结果，时间长，并且也不适用于床边测试。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器以及其制备方法和将生物传感器用于检测atp，该生物传感器具有较高的灵敏度和特异性，能专门识别和结合atp序列，降低了常见的交叉反应和假阳性的可能性，在crispr-cas12a系统下，能充分放大atp结合生物传感器的荧光信号，检测效率加快，还能用于检测低浓度的atp和适应于床边测试。
2、第一方面，本专利技术提供基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器，以g-
3、在本专利技术中，g-四链体是一种特殊的dna或rna二级结构，其中含有鸟嘌呤(g)的序列可以形成稳定的四重螺旋结构。这种结构是在富含g的dna或rna序列中，多个g碱基通过hoogsteen氢键相互作用形成平面的g-四分体(g-tetrad)，并通过g-四分体之间的π-π堆积力和阳离子(如k+或na+)的稳定作用，堆叠起来形成四链体结构，tht的苯并噻唑环结构能够通过π-π堆积作用与g-四分体的π电子云相互作用，插入到g-四链体的g-四分体之间，在crispr-cas12a系统中，grna引导cas12a酶到目标dna的切割靶位点进行切割，grna与目标dna结合后，cas12a在dna中引入g-quadruplex-tht，出现荧光，表明atp的存在，cas12a酶还能对其他ssdna进行靶位点切割，避免g-quadruplex与ssdna荧光结合，使荧光熄灭。
4、第二方面，本专利技术提供如第一方面基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
5、s21、将g-quadruplex序列在tris-hcl缓冲体系下溶解，随后在kcl梯度体系下加热，得到g-四链体；
6、s22、在活化的cas12a体系中，将g-四链体与tht溶液混合，经孵育后在激发波长320nm和发射波长490nm条件下，进行荧光测定，当溶液颜色由亮绿色逐渐变至接近无色，则g-quadruplex-tht响应较好。
7、本专利技术中，步骤s21中，加热条件为95℃，保持5min，随后冷却至室温。
8、在本专利技术中，通过kcl梯度体系，含有的k+促进g-四链体的形成和稳定，在保持5min后，使g-四链体变成寡核苷酸，以便在cas12a酶到特定的dna序列进行切割或编辑，在冷却至室温后，以确保g-四链体结构的形成和稳定。
9、优选的，步骤s21中，tris-hcl缓冲体系选用(100mm，ph7.4)，选用浓度为20μm。
10、优选的，步骤s21中，kcl梯度体系浓度为50mm、100mm、150mm、200mm。
11、优选的，步骤s22中，cas12a体系浓度为100μl，g-四链体浓度为8μm，tht溶液浓度为20μm。
12、优选的，步骤s22中，孵育条件为37℃下孵育60min。
13、第三方面，本专利技术提供基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器用于atp的检测。
14、优选的，采用g-quadruplex-tht生物传感器用于atp的检测，包括如下步骤：
15、配制的cas12a、crrna和dsdna溶液；加入由如权利要求2～6任一项所述的基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器，在450～600nm测定atp-待测样品荧光发光谱，利用500nm处的荧光强度测定atp浓度。
16、在本专利技术中，当cas12a、crrna和dsdna溶液加入g-quadruplex-tht生物传感器时，需确保总反应体积为100μl。
17、在本专利技术中，在没有atp的情况下，crrna和dsdna与crrna-cas12a双链杂交，增加cas12a的转切割能力，在crispr-cas12a系统中，cas12a酶切割周围的g-四链体序列，避免g-quadruplex-tht的形成，从而导致荧光效果差；在存在atp的情况下，crrna和dsdna以高特异性和亲和力与g-quadruplex-th结合，导致杂交到crrna-cas12a双链的适配体数量减少，但tht可以诱导完整的g-四链体自组装成g-quadruplex-tht，荧光显著增强，从而避免活化的cas12水平下降，g-四链体旁切割活性降低的情况
18、优选的，cas12a溶液浓度为0.25μm，crrna溶液浓度为0.2μm，dsdna溶液浓度为0.05μm。
19、优选的，crrna序列为seq id no.23。
20、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
21、1.本专利技术的g-quadruplex序列在kcl的梯度体系下形成了稳定的g-四链体结构，tht通过π-π堆积组装在g-四链体结构上，形成g-quadruplex-tht结构，增强了荧光信号，具有特异性。
22、2.在crispr-cas12a系统中，cas12a能有效地对目标dna的酶切靶位点进行切割，在目标dna中引入g-quadruplex-tht，在320nm激发和490nm发射波长下，出现g-quadruplex-tht的荧光，在450～600nm荧光发光谱中，出现荧光，表明atp的存在，在没有atp的情况下，crispr-cas12a系统中的cas12a酶切割周围的g-四链体序列，避免g-quadruplex-tht的形成，从而导致荧光效果差，cas12a酶还能对其他ssdna进行靶位点切割，避免g-quadruplex与ssdna荧光结合，使荧光熄灭。
23、3.本专利技术中制备的g-quadruplex-tht检测灵敏度高，具有普适性。
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1.基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-ThT生物传感器，其特征在于，以G-四链体序列作为结构主体，ThT作为染色剂，ThT连接在G-四链体序列，所述G-四链体序列为SEQID NO.7。
2.基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-ThT生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S21中，Tris-HCL缓冲体系选用(100mM，pH7.4)，选用浓度为20μM。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S21中，KCl梯度体系浓度为50mM、100mM、150mM、200mM。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S22中，Cas12a体系浓度为100μL，G-四链体浓度为8μM，ThT溶液浓度为20μM。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S22中，孵育条件为37℃下孵育60min。
7.基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-Th
8.根据权利要求7所述的基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-ThT生物传感器用于ATP的检测，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-ThT生物传感器用于ATP的检测，其特征在于，Cas12a溶液浓度为0.25μM，crRNA溶液浓度为0.2μM，dsDNA溶液浓度为0.05μM。
10.根据权利要求8或9所述的基于CRISPR-Cas12a系统构建G-quadruplex-ThT生物传感器用于ATP的检测，其特征在于，crRNA序列为SEQ ID NO.23。
...【技术特征摘要】
1.基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器，其特征在于，以g-四链体序列作为结构主体，tht作为染色剂，tht连接在g-四链体序列，所述g-四链体序列为seqid no.7。
2.基于crispr-cas12a系统构建g-quadruplex-tht生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s21中，tris-hcl缓冲体系选用(100mm，ph7.4)，选用浓度为20μm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s21中，kcl梯度体系浓度为50mm、100mm、150mm、200mm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s22中，cas12a体系浓度为100μl，g-四链体浓度为8μm，tht溶液浓度为20μm。
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘春萍，陈峰，王磊，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：
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