【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物促生和土壤修复，具体涉及一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法及在植物促生和土壤修复中的应用。
技术介绍
1、邻苯二甲酸酯(paes)是一类广泛用为工业增塑剂的化合物，其作为增塑剂到目前为止还没有找到合适的替代品，预计未来paes的产量和消耗将保持在高位。随着农业薄膜、棚室和农药化肥等生产资料的使用，邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(dehp)和邻苯二甲酸二丁酯(dbp)在土壤中经常被广泛检出。土壤作为污染物的源和汇，paes在土壤中的分布受人为行为、土壤类型和paes性质等因素的影响，微生物对paes的降解程度取决于污染物本身的结构和性质，且降解效率随着分子量的变化而变化。
2、现有研究表明，细菌驱动的生物降解因其污染物降解完全、处理成本低、安全性高及对环境干扰小被认为是众多的修复方式中最有前途的策略。目前，实验室水平分离纯化出多株具有单一paes降解能力的降解菌株，部分菌株在实验室研究中表现出较好的降解效果，但并不具有paes广谱降解能力。土壤作为天然微生物资源库，单株降解菌在高度复杂的土著细菌群落中缺少竞争力，因而通过科学手段构建可调控、可组装、互作机制明确、功能稳定且有竞争力的多功能微生物群落在土壤微生物修复及提高植物生产潜力的极其关键。
3、近年来，合成微生物生态学的思想虽然已经建立，但应用于生产实际的合成微生物菌群案例还不够丰富。生物炭作为农业废弃物资源化产物，因其优越的理化性质和多孔结构等特性近年来多被用来土壤改良。生物炭丰富的孔隙结构被认为是优越的微生物固定化材料，不仅为微生
4、黄瓜作为主要的设施农业蔬菜，占据重要农业经济地位，通常种植于棚式设施或用地膜覆盖，土壤环境中差异类型、浓度的paes残留致使黄瓜幼苗、生长和产量受到胁迫。不仅如此，paes具有内分泌干扰效应，人类食品健康安全受到巨大威胁。因此paes的生态安全问题及植物对其胁迫的响应受到了关注。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决目前单一降解菌株不具备paes广谱降解能力，以及单一降解菌株在土著细菌群落中对于paes降解效果不稳定的问题，而提供一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法及在植物促生和土壤修复中的应用。
2、一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，按以下步骤进行：
3、步骤s1：假单胞菌(pseudomonas sp.)dnb-s1培养；
4、将假单胞菌(pseudomonas sp.)dnb-s1接种至含有邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯组成的混合物质的lb培养基中，接种量为1～5％，并在25～35℃的温度和ph值为6～9的条件下摇床培养6～8h，得到dnb-s1菌体；
5、步骤s2：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)mes810培养；
6、将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)mes810接种至含有邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯组成的混合物质的lb培养基中，接种量为1～5％，并在25～35℃的温度和ph值为6～9的条件下摇床培养6～8h，得到mes810菌体；
7、步骤s3：中间产物制备；
8、将步骤s1中的dnb-s1菌体培养至od＝1，以及将步骤s2中的mes810菌体离心，然后共同接种至质量分数为0.5～1％的生物炭的pbs缓冲液中，摇床负载6～8h后，得到中间产物，dnb-s1菌体与离心后的mes810菌体的体积比为1：1；
9、步骤s4：生物炭负载合成微生物菌剂制备；
10、将步骤s3中的中间产物接种至含有邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯组成的混合物质的无机盐培养基中，接种量为1～5％，并在25～35℃的温度和ph值为6～9的条件下摇床培养6～8h，得到生物炭负载合成微生物菌剂。
11、一种生物炭负载合成微生物菌剂的应用，所述的生物炭负载合成微生物菌剂在降解土壤中的邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯，以及促进黄瓜生长和抗黄瓜枯萎病中的应用。
12、本专利技术的原理：
13、本专利技术选择对植物生长有益的微生物作为土壤环境调理剂，充分利用环境污染物作为微生物本身生长所需要的碳源和能源，利用环境污染物及其次级代谢产物与环境中其他有机物进行共代谢，实现合成微生物群落在实际应用中的的功能稳定的生态稳定，从污染治理和植物促生两方面入手指导实践应用的合成菌群。
14、本专利技术构建功能稳定的、可组装的微生物群落，实现边修复边生产，基于模型及应用验证评价合成微生物群落的生态稳定性、群落成员生长状况；探究多功能微生物群落对黄瓜的促生效果；动态监测合成微生物群落修复过程中土壤paes的残留量，黄瓜各部分paes的含量，评估多功能合成菌群对黄瓜吸收土壤paes的阻控能力，阐释实际应用中合成微生物群在落驱动土壤健康、植物健康，调控“土壤-受胁迫植物生态系统”可持续发展中发挥的关键功能。
15、本专利技术构建的合成微生物菌剂对dbp的降解及利用表现出更为优异的性能，其对dbp的48小时降解速率大于仅有dnb-s1降解菌时的降解速率。其中，生物炭的孔隙为微生物的栖居提供了适宜的环境，既避免了高浓度dbp对细菌的损伤，又促进了吸附在生物炭上的dbp被dnb-s1的利用，有利于细菌的趋化性；生物炭中含有的碱性物质调节了dbp次级代谢产物增加致使逐渐变酸的培养基环境，提高了微生物生长和代谢的稳定性。
16、本专利技术构建的合成微生物菌剂中枯草芽孢杆菌mes810增强dnb-s1菌株降解基因的高效表达活性，增加dnb-s1对dbp的代谢强度。dnb-s1菌株降解基因高效表达改善mes810菌株对环境的响应，营造了mes810菌株更有利的生存空间，使mes810菌株在paes胁迫条件下生防特性保持稳定。dnb-s1与mes810菌株选择性利用菌株代谢物如简单有机碳化合物，激活菌株生长、菌株降解及抗菌物质产生。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术提供一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，包括dnb-s1和mes810复配而成，在生长特性方面，dnb-s1 72h可降解500mg·l-1的邻苯二甲酸二丁酯(dbp)的可降解95％以上；mes810对黄瓜枯萎病有明显的抑菌作用，实验室试验得出在pda固体培养基中对黄瓜枯萎病病害菌株抑菌试验7天抑菌率为55.7％，抑制直径为38.57mm。同时生物炭的负载维持了合成微生物菌剂稳定性和高效降解特性。复配后，在含有500mg·l-1dbp的无机盐培养基中，48小时paes降解能力达95％以上。可见，本专利技术合成的微生物菌剂具有较高的paes修复能力及较强的植物生防能力。
19、本专利技术制备的多功能合成微生物菌剂可以在含有pa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S1和步骤S2中每1L LB培养基均由10g·L-1胰蛋白胨、5g·L-1酵母提取物和10g·L-1氯化钠组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于每1L LB培养基中邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯的浓度均为100～500mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S1中摇床的转速为125～175r·min-1。
5.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S2中摇床的转速为125～175r·min-1。
6.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S3中摇床的转速为125～175r·min-1。
7.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S4中每1L无机盐
8.根据权利要求1或7所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于每1L无机盐培养基中邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯的浓度均为100～500mg·L-1。
9.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤S4中摇床的转速为125～175r·min-1。
10.如权利要求1-9任意一项所述的方法制备的一种生物炭负载合成微生物菌剂的应用，其特征在于所述的生物炭负载合成微生物菌剂在降解土壤中的邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯，以及促进黄瓜生长和抗黄瓜枯萎病中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤s1和步骤s2中每1l lb培养基均由10g·l-1胰蛋白胨、5g·l-1酵母提取物和10g·l-1氯化钠组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于每1l lb培养基中邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸二丁酯的浓度均为100～500mg·l-1。
4.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤s1中摇床的转速为125～175r·min-1。
5.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤s2中摇床的转速为125～175r·min-1。
6.根据权利要求1所述的一种生物炭负载合成微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤s3中摇床的转速为125～175r·min-1。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，王蕾，陈劼，管芮，王晓东，祁泽伟，王磊，党金霞，魏世锋，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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