【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学，具体涉及一种采用hplc-esi-ms/ms技术检测尿草酸的方法。
技术介绍
1、草酸是较强极性的小分子酸性物质，从技术角度看尿草酸（uox）的测定是具有挑战性的。在国际上，尿草酸浓度分析技术也一直是临床化学领域的热点之一。一种可靠的分析方法是实施有价值的尿草酸浓度监测的必要条件。
2、近年来，报道了各种检测尿草酸的方法，包括酶法、hplc、lc-ms/ms、gc-ms、离子色谱、比色法、荧光法、电化学方法等。然而，这些方法存在一些缺点，如酶免免疫分析法特异性低，试剂盒昂贵；气相色谱实用性差，耗时长，需要复杂的柱前衍生化；而一些其他方法存在需要冗繁的样品前处理（如需要进行酸化）、液液萃取和固相萃取效率低，生物样品消耗量大（≥100 μl），以及准确性低的问题。此外，这些方法测定的尿样多为24小时尿样，不适用于24小时尿样采集不方便或困难的患者。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种采用hplc-esi-ms/ms技术检测尿草酸的方法。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种采用hplc-esi-ms/ms技术检测尿草酸的方法，包括以下步骤：
4、s1、取采集样本，加入草酸-1，2-13c 作为草酸的内标，将内标溶液与采集样本按照2:1的比例混合，涡旋5 min后，4000 rpm离心5 min，得到尿液样品；
5、s2、利用液相色谱串联质谱仪进行样品检
6、液相色谱系统高压泵a流动相：体积百分比为0.01%的氨水-1mm 乙酸铵-超纯水溶液；
7、液相色谱系统高压泵b流动相：体积百分比为0.01%的氨水-1mm 乙酸铵-乙腈溶液；
8、色谱条件中，色谱柱为a waters symmetry c18 column，3.5 µm，4.6 mm × 75mm，柱温40℃；检测模式 mrm，离子源温度 500℃；流速 0.4 ml/min；梯度洗脱程序为：体积百分比为70%的流动相a+体积百分比为30 %的流动相b，等度运行3 min；进样量为5µl；洗针模式：进样前后洗针液清洗5s；
9、质谱条件为：气帘气35 psi，喷撞气 4psi，离子化电压 4000v，离子源温度 500℃，喷雾气 50psi，辅助加热气 50psi；
10、s3、采用稳定同位素标记的草酸-1，2-13c 作为草酸的内标，通过制备一系列不同浓度的标准品，制作标准曲线，以草酸工作标准溶液的浓度为x轴，读取结果的标准和内标峰面积比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x2”权重得到回归方程；将样品中草酸与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算尿液样品中的草酸浓度。
11、优选地，所述步骤s1中质谱条件包括草酸及其同位素草酸-1，2-13c的电参条件，具体如下：
12、草酸：母离子 88.9da，子离子 60.8da，扫描时间 200 msec，去簇电压 40v，入口电压 7v，碰撞能量 10v，碰撞室出口电压 15v；
13、草酸-1，2-13c：母离子 90.8da，子离子 61.8da，扫描时间 200 msec，去簇电压14v，入口电压 2v，碰撞能量 10v，碰撞室出口电压 4v。
14、优选地，所述步骤s2中相关试剂的组分及其含量为：
15、洗针液：体积百分比为40%的甲醇、体积百分比为40%的乙腈、体积百分比为10%的异丙醇、体积百分比为10%的超纯水；
16、内标溶液：用甲醇溶解草酸-1，2-13c，制备成1.00 mg/ml的内标原液，再用含体积百分比为0.3%氨水的乙腈稀释至200 ng/ml；
17、校准曲线溶液：用甲醇溶解草酸，制备1.00 mg/ml的草酸原液；将甲醇：水按照1:1的体积稀释原液，分别得到浓度为0.2、0.5、1、5、50、50、100、250和500 μg/ml的草酸工作标准溶液；使用超纯水稀释草酸工作标准溶液，制备浓度分别为0.020、0.050、0.100、0.500、10.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/ml的标准曲线溶液；
18、质控溶液qcs：先用甲醇水按照1:1的体积稀释1.00 mg/ml的草酸原液，分别得到浓度为0.2、1、50、400 µg/ml的草酸质控工作标准溶液使用超纯水稀释草酸质控工作标准溶液，分别得到浓度为0.020、0.100、5、40.0 µg/ml的质控样品；
19、校准曲线样品和质控样品：将200 μl的沉淀剂分别与100 μl的校准曲线溶液、质控溶液qcs混合，涡旋5 min后，4000 rpm离心5 min，分别得到校准曲线样品、质控样品。
20、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
21、1.本专利技术无需进行衍生化、固相萃取、酸化操作，大大简化了分析技术，缩短检测时间，提高了样本的稳定性；
22、2.本专利技术能够检测包括但不限于24h的尿样，在24h尿液样品收集不便或困难的情况下，通过本专利技术的检测方法结合尿肌酐的检测数据可计算样品中的草酸含量，增加了本专利技术的应用场景；
23、3.将0.01%nh3∙h2o和1mm nh4ac作为添加剂，有利于草酸进行质谱电离；
24、4.选择草酸-1，2-13c为内标，其具有与分析物完全相同的结构，因此能够消除基质效应，使结果更准确。
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1.一种采用HPLC-ESI-MS/MS技术检测尿草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种采用HPLC-ESI-MS/MS技术检测尿草酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中质谱条件包括草酸及其同位素草酸-1，2-13C的电参条件，具体如下：
3.根据权利要求1所述的一种采用HPLC-ESI-MS/MS技术检测尿草酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中相关试剂的组分及其含量为：
【技术特征摘要】
1.一种采用hplc-esi-ms/ms技术检测尿草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种采用hplc-esi-ms/ms技术检测尿草酸的方法，其特征在于，所述步骤s1中质谱...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈峰，王洁，郭宏丽，徐进，赵非，
申请(专利权)人：南京市儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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