【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学领域，更具体地说，该技术涉及用于发现和识别配体与受体特异性以及基因和蛋白质传递的方法和组合物。具体而言，涉及一种用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞、及其制备方法和应用。
技术介绍
1、t细胞是一种免疫细胞，在免疫应答中起关键作用。t细胞表面有一种特定的受体，称为t细胞受体(tcr)，用于识别抗原。
2、mhc在小鼠中称为主要组织相容性复合体(mhc)，在人类中称为人类白细胞抗原(hla)。mhc/hla是细胞表面的蛋白质复合体，用于呈递抗原肽(短的蛋白质片段)。癌细胞在其代谢过程中会产生异常的蛋白质，这些蛋白质被分解成肽段。这些肽段被细胞内部的蛋白酶处理后，通过细胞内的加工机制被装载到mhc/hla分子上，并运输到细胞表面。当t细胞在巡逻体内时，tcr会扫描细胞表面的mhc/hla分子。如果tcr识别并与mhc/hla呈递的特定抗原肽紧密结合，这通常意味着该细胞表现出异常的或非自我的标志，例如癌细胞标志。这种结合触发t细胞激活。激活后的t细胞可以释放细胞因子、繁殖并分化为效应t细胞(如细胞毒性t细胞)。这些效应t细胞有能力直接攻击并杀死呈递癌性抗原的细胞。因此，t细胞相关的免疫反应可以引发抗原导向的细胞毒性，并且在抗癌过程中起着关键作用。
3、基于这一原理，科学家开发了一些免疫疗法。例如：car-t细胞疗法：患者的t细胞被从体内提取、在实验室中被修改以表达特定的嵌合抗原受体(car)，这种受体能够识别癌细胞表面的特定抗原。修改后的t细胞被扩增后回输到患者体内，以增强其识别和
4、tcr-t细胞疗法：与car-t类似，但t细胞被改造以表达特定的tcr，这种tcr能够识别与癌症相关的特定抗原-mhc/hla复合物。这些改造后的t细胞回输到患者体内后，能够有效识别并攻击癌细胞，减少肿瘤负担并延长患者生存期。
5、细胞通过配体-受体相互作用传导信号。丰富的细胞间通信塑造了哺乳动物细胞的分子程序，以指导特定行为和细胞命运决策。例如，t细胞表面上的tcr可以识别并与抗原呈递细胞表面的主要组织相容性复合物(mhc)-抗原复合物相互作用。tcr和抗体基因经历体细胞重组以达到一个庞大且多样的库(在人类中约有1016个tcr alpha和beta序列)，抗原特异性的t细胞和b细胞扩增分化高度依赖tcr和bcr的特异性。解析tcr-抗原相互作用，特别是将特异性抗原对应到特异性tcr序列和t细胞状态对于理解抗原识别如何驱动t细胞命运决策至关重要。
6、研究者已经开发了各种方法来解读tcr的抗原特异性，包括:(1)细胞报告基因分析，使用人工apcs筛选t细胞特异性mhc-抗原，如t-scan、sabr、t细胞吞噬作用和细胞因子捕获分析(joglekar等，2019年；kula等，2019年；lee and meyerson，2021年；li等，2019年)；(2)酵母展示平台，用于筛选用于重组tcr的mhc-抗原(birnbaum等，2012年)；(3)基于t细胞的实验，如抗原肽刺激后的细胞因子产生(elispot)(mccutcheon等，1997年)；(4)使用dna条形码的mhc-肽多聚体，通过单细胞测序捕获抗原特异性和tcr序列(tettcr-seq；zhang等，2018年)。尽管每种技术各自具有独特的优势，但快速筛选初始t细胞对mhc-抗原的免疫原性并同时捕获抗原对应的tcr库和t细胞基因表达特征仍然具有挑战性。许多现有方法需要在异质细胞上重新表达受体或配体，因此不能直接应用于人类临床样本。类似的挑战也适用于研究b细胞受体-抗原相互作用，其面临的额外挑战是解决抗体识别的已知细胞内抗原表位。
7、尽管在表征抗原特异性的t细胞和b细胞的细胞状态方面取得了巨大进展，但在不干扰其他旁观者t细胞或b细胞的情况下有选择地重构它们的细胞状态和行为仍具有很大挑战性。最近的一种方法使用呈现pmhc的纳米粒子已经实现了在特定抗原t细胞中的mrna传递，为瞬态调节特定t细胞提供了许多可能性(su等人，2022)。另一项最新研究使用呈现pmhc伪型病毒允许对特定抗原t细胞进行基因修改(guo和elledge，2022)。然而，仍然缺乏一种技术，可以选择性地操纵特定b细胞而不仅限于特定t细胞。
8、目前，通过ngs和mhc-肽结合预测算法可以预测潜在的新抗原肽，但这些方法的效率仍存在争议，存在效率低的问题。质谱法可用于鉴定肿瘤细胞呈递的新抗原，但由于高背景和肿瘤组织数量限制，其临床应用有限。
9、此外，现有技术需要将全部的hla编码基因和抗原肽通过连接子连接从而构建慢病毒载体，转染后获得细胞表面表达hla分子-多肽复合物；由于hla-多肽复合物是融合连接表达的，不能有效反映体内的天然构象hla-多肽复合物的递呈。此外，hla融合表达配体的策略进一步限制了慢病毒的基因装载长度。这些不足进一步限制了在精确地、高效地标记或识别特异性t细胞等方面的应用。
10、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞、及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞的制备方法，其包括如下步骤：
4、s1：构建单一hla基因的细胞系：
5、以hla全敲除以及tap1不表达的细胞为底盘细胞，将携带单一hla编码基因的慢病毒感染底盘细胞，获得含有单一hla基因但细胞表面不表达hla分子的细胞系；
6、s2：构建包括配体编码基因和靶向内质网的信号肽序列的慢病毒载体，然后将包括配体编码基因和靶向内质网的信号肽序列的慢病毒感染单一hla基因的细胞系，培养，经细胞分选，获得细胞表面为hla阳性的细胞，细胞表面为hla阳性的细胞展示天然构象的hla特定多肽复合物。
7、第二方面，本专利技术还提供了一种带有标记的用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞的制备方法，取上述的方法制得用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞，与带有标记基因的质粒、包装质粒、辅助质粒共转染。
8、第三方面，本专利技术还提供了由上述方法制备的用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞，或，由上述制备方法制备的带有标记的用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞。
9、第四方面，本专利技术还提供了慢病毒或细胞在t细胞标记、t细胞激活、识别或鉴定b细胞受体的抗原、鉴定b细胞受体或抗体、识别或鉴定t细胞受体和成对pmhc、鉴定免疫原表位、鉴定目的细胞中的核酸或蛋白、鉴定配体受体对或制备抗肿瘤产品中的应用。
10、本专利技术具有以下有益效果：
11、本专利技术提供了能展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞的制备方法，该方法利用慢病毒技术，以hla及tap1不表达的细胞为底盘细胞，先获得含有单一hla基因但细胞表面不本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于展示天然构象的HLA多肽的慢病毒或细胞的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述配体为表位或蛋白质；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，以TAP1、HLA不表达以及如下至少一种蛋白不表达的细胞为底盘细胞：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，构建的慢病毒载体中的配体编码基因包括肿瘤突变位点编码基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括先进行包括配体编码基因和靶向内质网的信号肽序列的慢病毒包装，所述慢病毒包装包括：将所述慢病毒载体、辅助质粒、包装质粒与宿主细胞共转染。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
7.一种带有标记的用于展示天然构象的HLA多肽的慢病毒或细胞的制备方法，其特征在于，取权利要求1-6任一项所述的方法制得用于展示天然构象的HLA多肽的慢病毒或细胞，与带有标记基因的质粒、包装质粒、辅助质粒共转染；
8.如权
9.如权利要求8所述的慢病毒或细胞在T细胞标记、T细胞激活、识别或鉴定B细胞受体的抗原、鉴定B细胞受体或抗体、识别或鉴定T细胞受体和成对pMHC、鉴定免疫原表位、鉴定目的细胞中的核酸或蛋白、鉴定配体受体对或制备抗肿瘤产品中的应用；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述识别或鉴定T细胞受体和成对pMHC的应用方式包括：pMHC在慢病毒表面显示，宿主细胞包括针对pMHC的T细胞受体、一个与慢病毒的结构蛋白连接的报告蛋白和一个带有接头序列的RNA，所述报告蛋白由所述标记基因编码；将所述慢病毒与细胞群体混合；根据报告蛋白的存在对细胞群体进行分类，从而鉴定T细胞受体；所述结构蛋白为核衣壳蛋白；
...【技术特征摘要】
1.一种用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述配体为表位或蛋白质；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，以tap1、hla不表达以及如下至少一种蛋白不表达的细胞为底盘细胞：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，构建的慢病毒载体中的配体编码基因包括肿瘤突变位点编码基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2包括先进行包括配体编码基因和靶向内质网的信号肽序列的慢病毒包装，所述慢病毒包装包括：将所述慢病毒载体、辅助质粒、包装质粒与宿主细胞共转染。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
7.一种带有标记的用于展示天然构象的hla多肽的慢病毒或细胞的制备方法，其特征在于，取权利要求1-6任一项所述的方法制得用于展示天然构...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈明，陶永辉，杨琳，
申请(专利权)人：上海善生实业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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