本发明专利技术涉及一种利用细胞成像测定ＨＢＶ增殖所必需的衣壳蛋白与表面蛋白之间的相互作用（结合强度）并由此来筛选ＨＢＶ增殖抑制剂的方法，更确切地说涉及一种测定细胞成像变化的方法，所述的细胞成像变化是由包含ＨＢＶ表面蛋白的ＰｒｅＳ结构域和ＰＨ（普列克底物蛋白同源）结构域序列的融合蛋白同与所述融合蛋白相互作用的、包含衣壳蛋白和荧光蛋白（ＧＦＰ）的融合蛋白之间相互作用所引起的。本发明专利技术在细胞水平上测定ＨＢＶ增殖所必需的蛋白之间相互作用的方法可以有效用于在细胞水平上筛选新的ＨＢＶ增殖抑制剂。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种利用细胞成像测定乙型肝炎病毒(HBV)增殖所必 需的衣壳蛋白和表面蛋白之间的相互作用(结合强度)并由此来筛选HBV 增殖抑制剂的方法，更确切地说涉及一种测定细胞成像变化的方法，所 述细胞成像变化由包含HBV表面蛋白的PreS结构域和PH (普列克底物 蛋白同源(Pleckstrin homology))结构域序列的融合蛋白同与上述融合 蛋白相互作用的包含衣壳蛋白和荧光蛋白(GFP)的融合蛋白之间相互 作用引起。
技术介绍
HBV是引起乙型肝炎的嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)家族的 成员。全世界有大约两亿人是HBV携带者。已经研制并广泛应用了 HBV 疫苗，但是用于那些感染者的HBV治疗剂仅限于拉米夫定和干扰素。拉 米夫定抑制HBV DNA聚合酶的活性，但长期给药时，其可产生耐药性 病毒，表明其应用是受限制的，因此需要研制各种HBV治疗剂。已经研制了作为HBV抑制剂的干扰素、核酸衍生物或免疫调节剂， 但是效果还令人怀疑。因此，正在研究以寻找具有阻碍病毒受体结合或 抑制活性蛋白或其聚合酶作用的HBV抑制剂。已经在努力研制抑制HBV 蛋白各种活性的药剂。在HBV感染细胞中，HBV衣壳蛋白与表面蛋白 的相互作用对于HBV的装配必不可少。HBV衣壳蛋白结合于HBV核酸， 形成直径为30 nm的核衣壳颗粒(nucleocapsid particle)。作为HBV表面 蛋白的三种蛋白(L、 M和S蛋白)由一种基因(S基因)生物合成，其 在细胞的内质网脂膜中表达，然后特异性结合于所述核衣壳。同时，内 质网脂膜包裹所述HBV核衣壳，形成完整的HBV颗粒(VolkerB &Don G，尸A^4S USA 88:1059-1063， 1991)。其中，表面蛋白L的N末端上的 第1-163位氨基酸残基的结构域(特别命名为PreS)与HBV核衣壳上的 衣壳蛋白选择性地相互结合以形成HBV颗粒。这两种蛋白之间的相互作5用可为研制HBV增殖抑制剂的靶标。为了筛选HBV衣壳蛋白与表面蛋 白之间的相互作用，已经开发出了一种利用重组蛋白的免疫方法 (Asif-Ullah M等人，^""Wra/細70; 85-90， 2006)。该方法的特点在 于利用一种在大肠杆菌中表达的重组蛋白。作为测量化合物生物活性的方法，除了测定纯化的靶蛋白活性的方 法之外，在新药研制过程中，积极尝试利用细胞来测定靶蛋白活性的方 法。在靶细胞中测定化合物生物活性的方法具有同时检测耙化合物细胞 渗透性和毒性的优点，这使其成为一种有效的筛选方法。在HBV感染细胞中，HBV衣壳蛋白和包含HBV核酸的核衣壳颗粒 特异性结合于在内质网膜中表达的HBV表面蛋白，从而形成活性的HBV 颗粒。HBV蛋白的结合取决于HBV衣壳蛋白与表面蛋白的PreS结构域 之间的选择性相互作用。所以，如果可以在细胞水平上筛选HBV衣壳蛋 白与表面蛋白的PreS结构域的相互作用，将筛选出一种能够抑制那些蛋 白之间相互作用的化合物。因此，由此筛选的化合物能够抑制HBV增殖， 从而能用作HBV介导的肝炎的治疗剂。本专利技术涉及一种在荧光显微镜下测定荧光信号的细胞分布变化的方 法，所述的荧光信号由包含HBV表面蛋白的PreS结构域和起膜耙向作 用的PH序列的融合蛋白同与所述融合蛋白相互作用的包含衣壳蛋白和 荧光蛋白(GFP)的融合蛋白之间的相互作用产生。本专利技术的方法是一 种在细胞水平上筛选HBV增殖所必需的蛋白之间相互作用的方法，因此 其可有效用于筛选新的HBV增殖抑制剂。本专利技术人研制了一种在细胞水平上测定HBV衣壳蛋白与表面蛋白 相互作用的方法，并且证实该方法通过阻碍HBV衣壳蛋白与表面蛋白之 间相互作用可有效用于筛选能抑制HBV增殖的化合物，进而完成本发 明。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种通过在细胞水平上测定HBV衣壳蛋 白与表面蛋白之间的相互作用来有效筛选HBV增殖抑制剂的方法。 为实现上述目的，本专利技术提供了一种表达载体，其包含多聚核苷酸，其编码HBV衣壳蛋白结构域与荧光蛋白相连的融合蛋 白；以及另一多聚核苷酸，其编码HBV表面蛋白的PreS结构域与起细胞膜 靶向作用的特定蛋白结构域相连的融合蛋白。本专利技术还提供了由表达载体l和表达载体2转染的动物细胞，其中， 表达载体1包含编码HBV表面蛋白的PreS结构域与起细胞膜靶向作用 的特定蛋白结构域相连的融合蛋白的多聚核苷酸；表达载体2包含编码 与上述融合蛋白相互作用的HBV衣壳蛋白与荧光蛋白相连的融合蛋白 的多聚核苷酸。本专利技术还提供了一种用于筛选HBV增殖抑制剂的方法，包括以下步骤1) 在培养期间将候选物处理到动物细胞中；2) 应用荧光显微镜拍摄在步骤1)中表达的荧光蛋白的荧光图像；和3) 选择位于荧光图像上的细胞质中的候选物。本专利技术还提供了一种包含所述动物细胞的HBV增殖抑制剂的筛选 试剂盒。本专利技术的用于筛选HBV增殖所必需的蛋白相互作用的方法可以有 效用于在细胞水平上筛选新的HBV增殖抑制剂。附图说明参考附图可更好地理解本专利技术优选实施方式的应用，其中图1是显示HBV (乙型肝炎病毒)表面蛋白的PreS结构域与靶向 细胞膜的PH结构域的N-末端相连的融合蛋白(PreS-PH)以及衣壳蛋白 (HBcAg)与绿色荧光蛋白(GFP)的N-末端相连的融合蛋白(衣壳-GFP) 的结构示意图。图2是显示同时表达PreS-PH、衣壳-GFP和突变体PreS-PH的表达 载体的酶切图的示意图a: pHBsPH-HBcGFP; b: pHBc-GFP;以及c: pAHBsPH曙HBcGFP。图3是显示衣壳-GFP通过与PreS-PH蛋白相互作用从细胞质向细胞膜转移的示意图。图4是显示当共表达PreS-PH融合蛋白时，通过与PreS蛋白相互作 用，在细胞的细胞质中表达的衣壳-GFP蛋白转移到细胞膜的荧光图像的 图a:pHBc-GFP; b: pHBsPH-HBcGFP;以及c: pAHBsPH-HBcGFP。图5是显示通过PreS衍生肽来抑制衣壳蛋白与PreS蛋白相互作用 的图。图6是显示由PreS-肽作用所产生的、在细胞质中观察到的在细胞中 与PreS-PH共表达的衣壳-GFP的荧光图像的图。具体实施例方式在下文中，详细描述本专利技术。本专利技术提供了一种表达载体，其包含编码HBV衣壳蛋白与荧光蛋白 相连的融合蛋白的多聚核苷酸，以及编码HBV表面蛋白的PreS结构域 与起细胞膜靶向作用的特定蛋白结构域相连的融合蛋白的另一多聚核苷 酸。可以通过将编码包含HBV衣壳蛋白与荧光蛋白的融合蛋白的多聚 核苷酸以及编码包含HBV表面蛋白的PreS结构域与细胞膜耙蛋白结构 域的融合蛋白的多聚核苷酸插入基本载体(basic vector)来制备所述表 达载体。用于本专利技术的基本载体可以是适用于动物细胞转染的任意载体， 其优选地选自由pBud-CE4.1、 pcDNA3.1、 pcDNA4和pEF6p构成的组， 但并非总限于此。在本专利技术的优选实施方案中，使用pBud-CE4.1。本文的衣壳蛋白可为能够与表面蛋白相互作用的全长的衣壳蛋白或 片段。在本专利技术的优选实施方式中，使用具有缺少前导序列的HBV衣壳 蛋白，SP:由序列编号19所示的氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达载体，其包含： 多聚核苷酸，其编码ＨＢＶ衣壳蛋白结构域与荧光蛋白相连的融合蛋白；以及 另一多聚核苷酸，其编码ＨＢＶ表面蛋白的ＰｒｅＳ结构域与起细胞膜靶向作用的特定蛋白结构域相连的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：全惠晟，吴受陈，柳然圭，金胤京，
申请(专利权)人：韩国科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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