RSV融合前构象F蛋白的突变体及其应用制造技术

技术编号：44325916 阅读：3 留言：0更新日期：2025-02-18 20:34

本发明专利技术涉及一种RSV融合前构象F蛋白的突变体，所述突变体相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493或493附近位置的氨基酸被C取代，突变后的392C和493C或493C附近位置之间形成二硫键。本发明专利技术还提供了相关的DNA编码序列、重组质粒和mRNA序列和相应RSV疫苗。本发明专利技术通过引入合适位置的二硫键，以及与空腔填充、静电突变、脯氨酸突变等组合，显著提高具有融合前后构象和三聚化构象的F蛋白的表达和稳定性，并且显著抑制F蛋白转变为融合后构象。本发明专利技术所述突变体也应用于制备RSV疫苗和用于呼吸道合胞病毒感染检测。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药，尤其涉及呼吸道合胞病毒f蛋白的融合前构象的突变体及其在呼吸道合胞病毒疫苗开发及呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用。

技术介绍

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，以下简称rsv)感染导致婴幼儿和老年人的大量发病率和死亡率，全球每年估计有6400万例感染和160,000例死亡，rsv感染引起的肺炎是导致临床死亡病例的首要原因。迄今为止，单克隆抗体的被动预防部分由于其适度的功效而仅限于高风险婴儿。目前我国还没有批准上市的针对rsv感染的安全有效的疫苗，突出了提供保护性免疫应答的rsv疫苗的迫切需求。

2、rsv基因组全长约15kb，包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白(f、g、m2-1、m2-2、sh、n、p、l)和3种非结构蛋白(ns1、ns2、ns3)。其中融合糖蛋白(fusionglycoprotein,f)和粘附糖蛋白(attachment glycoprotein,g)是两个主要的包膜糖蛋白。f蛋白属于i型病毒融合蛋白，介导病毒与宿主细胞的膜融合，使病毒包膜与宿主细胞膜融合形成多合胞体。针对f蛋白的中和抗体能有效抑制rsv病毒的感染，人体自然感染rsv诱导的中和抗体主要是针对f蛋白；f蛋白的氨基酸序列在rsv亚型间超过93％的一致性，遗传稳定性远远高于g蛋白，此外f蛋白是诱导机体产生cd8+t细胞的重要靶点。因此rsv f蛋白是开发rsv疫苗开发的重要靶点。

3、rsv的f蛋白为三聚体结构，通过构象变化来介导病毒包膜和宿主细胞的

4、为了解决融合前构想f蛋白(pre-f)结构不稳定的问题，通过在该蛋白特殊氨基酸位点引入突变对蛋白结构进行稳定，增加稳定性的同时也保留了f蛋白pre-f构象的中和敏感性表位。

技术实现思路

1、基于此，本专利技术的目的是提供一种rsv融合前构象f蛋白的突变体及其应用，所述融合前构象f蛋白的突变体能提高融合前三聚化构象f蛋白的表达水平和稳定性。

2、为实现上述目的，可包括如下技术方案。

3、本专利技术的第一方面，是提供一种rsv融合前构象f蛋白的突变体，所述突变体相对于野生型rsvf蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493的氨基酸或者位置493位附近的位置氨基酸分别被半胱氨酸取代，突变后的392c与493c之间，或者突变后的392c与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键。

4、在其中一些实施例中，所述493位附近位置包括491位，其突变为491c。

5、在其中一些实施例中，所述野生型rsvf蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

6、在其中一些实施例中，所述突变体还引入空腔填充突变，所述空腔填充突变选自以下至少一种：e60i、e60y、s62v、k80m、k87m、k87y、v90i、s150l、s150v、s150f、s150w、v154l、k168y、k168l、k191v、k191l、k191m、k427y、d448v、s190f和v207l、e60i和k191v、s150l和k191v、k191v和d448v、d448y、v154l和k191v、k168y和k191v、k191v和k427y、s150l和v154l、k427y和d448v、e60i和s62v、s190f和v207l，或者上述突变位点被任意疏水性氨基酸替代。

7、进一步优选地，所述空腔填充突变选自以下至少一种：k80m、k87m、k87y、v90i、v154l、k427y、d448y、以及190f和v207l。

8、在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的d392c与s493c之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括选自k80m、k87m、k87y、v154l、d448y、s190f和v207l中的至少一种。

9、在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的d392c与s491c之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括s190f和v207l突变。

10、在其中一些实施例中，还引入脯氨酸突变，所述脯氨酸突变选自以下至少一种：q210p、s213p、i214p、s215p、n216p、i217p、n183p、s182p、n175p、s173p、g162p、e161p、s213p和i214p、i214p和s215p、s215p和n216p、n216p和i217p、e161p和g162p。

11、在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的d392c与s493c之间突变后形成二硫键，以及k87m，或s190f与v207l的空腔填充突变，还包括选自以下至少一种脯氨酸突变：q210p、s213p、i214p、s215p、n216p、i217p、n183p、s182p、n175p、s173p、g162p、e161p、s213p和i214p、i214p和s215p、s215p和n216p、n216p和i217p、e161p和g162p。

12、在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的d392c与s491c之间突变后形成二硫键，以及s190f,v207l空腔填充突变，还包括i214p突变。

13、在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:3所示。

14、在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:5所示。

15、在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:7所示。

16、在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25、seq id no：27、seq id no：29、seq id no：31、seq id no：33、seq idno：35、seq id no：37、seq id no：39任一所示。

17、本专利技术的第二方面，是提供编码所述rsv融合前构象f蛋白的突变体的编码dna序列。

18、在其中一些实施例中，所述编码序列如seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种RSV融合前构象F蛋白的突变体，其特征是，所述突变体相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493的氨基酸或者位置493位附近位置氨基酸分别被半胱氨酸取代，突变后的392C与493C之间，或者突变后的392C与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述493位附近位置包括491位，其突变为491C。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入空腔填充突变，所述空腔填充突变选自以下至少一种：E60I、E60Y、S62V、K80M、K87M、K87Y、V90I、S150L、S150V、S150F、S150W、V154L、K168Y、K168L、K191V、K191L、K191M、K427Y、D448V、D448Y、S190F和V207L、E60I和K191V、S150L和K191V、K191V和D448V、V154L和K191V、K168Y和K191V、K191V和K427Y、S150L和V154L、K427Y和D448V、E60I和S62V、S

4.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括选自K80M、K87M、K87Y、V154L、D448Y、S190F和V207L中的至少一种；或

5.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入脯氨酸突变，所述脯氨酸突变选自以下至少一种：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P。

6.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及K87M，或S190F与V207L的空腔填充突变，还包括选自以下至少一种脯氨酸突变：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P；或

7.据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：39任一所示。

8.一种编码权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的DNA编码序列。

9.根据权利要求8所述的DNA编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40任一所示。

10.一种重组质粒，其插入有权利要求8-9任一项所述DNA编码序列。

11.编码权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的mRNA序列。

12.一种呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其特征在于，其包含至少一种核糖核酸聚核苷酸，其具有编码权利要求1-7任一项RSV F蛋白融合前构象的突变体或其免疫原性片段的开放阅读框架，及医药学上可接受的载体。

13.权利要求1-7...

【技术特征摘要】

1.一种rsv融合前构象f蛋白的突变体，其特征是，所述突变体相对于野生型rsv f蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493的氨基酸或者位置493位附近位置氨基酸分别被半胱氨酸取代，突变后的392c与493c之间，或者突变后的392c与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述493位附近位置包括491位，其突变为491c。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入空腔填充突变，所述空腔填充突变选自以下至少一种：e60i、e60y、s62v、k80m、k87m、k87y、v90i、s150l、s150v、s150f、s150w、v154l、k168y、k168l、k191v、k191l、k191m、k427y、d448v、d448y、s190f和v207l、e60i和k191v、s150l和k191v、k191v和d448v、v154l和k191v、k168y和k191v、k191v和k427y、s150l和v154l、k427y和d448v、e60i和s62v、s190f和v207l，或者上述突变位点被任意疏水性氨基酸替代；优选地，所述空腔填充突变选自以下至少一种：k80m、k87m、k87y、v90i、v154l、k427y、d448y以及190f和v207l。

4.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的d392c与s493c之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括选自k80m、k87m、k87y、v154l、d448y、s190f和v207l中的至少一种；或

5.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入脯氨酸突变，所述脯氨酸突变选自以下至少一种：q210p、s213p、i214p、s215p、n216p、i217p、n183p、s182p、n175p、s173p、g162p、e161p、s213p和i214p、i214p和s215p、s215p和n216p、n216p和i217p、e161p和g162p。

6.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的d392c与s493c之间突变后形成二硫键，以及k87m，或s190f与v207l的空腔填充突变，还包括选自以下至少一种脯氨酸突变：q210p、s213p、i214p、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弈，毕帅，康微，李丹丹，万季，潘有东，赵钊，
申请(专利权)人：北京新合睿恩生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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