【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种梨体细胞胚胎发生的方法。
技术介绍
1、梨是我国第三大果树品种，品种资源丰富，具有较高的经济价值。目前，梨主要采用传统的有性杂交方式进行新品种选育。但作为一种基因杂合度较高、自交不亲和、童期较长的木本植物，通过常规杂交育种进行遗传改良相当困难。与传统的梨遗传改良相比，基因工程育种是一种更加精确和省时的方法，可以选择特定性状，并将与目标性状相关基因引入梨植株体内,不会出现基因的大量重组，也可在一定程度上避开童期的干扰，最终获得所需的转基因材料。同时，随着梨基因组测序的成功，也加速了梨基因功能验证方面的研究。因此，梨高效遗传转化体系的建立和优化是通过同源转化验证基因功能，以及获得转基因新品系的前提。
2、高效遗传转化体系的前体条件是稳定高效的再生体系，植物再生的途径一般分为器官发生途径和体细胞胚胎发生途径。目前关于梨再生的研究，主要集中在器官发生途径，虽然目前有秋子梨、西洋梨等均100％再生效率的相关报道，但梨器官发生途径具有基因型依赖性，多种梨再生效率低，不能满足基因工程育种以及基因功能分子鉴定的要求。且器官发生途径多为经过愈伤组织的间接发生途径，诱导出的不定芽起源于多细胞或细胞团，遗传稳定性差，通过遗传转化获得的转基因材料多为嵌合体，转化效率不高。与器官发生途径相比，胚状体多起源于单细胞或小的细胞团，细胞变异频率较低，通过遗传转化获得转基因植株的遗传稳定性更好。同时体细胞诱导胚状体产生的数量比器官发生形成不定芽的数量多，且在适宜条件下会诱导出大量次生胚状体，因此具有较高增殖效率，也会有
3、影响体细胞胚胎发生的因素较多，包括基因型、外植体类型及生理状态、培养基类型和成分、培养环境等，因此，筛选到合适的外植体及培养基配方并诱导体细胞胚胎发生较为困难。所以目前关于梨体细胞胚胎发生途径报道较少，且尚无普适性好的体细胞胚胎诱导方法。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种梨体细胞胚胎发生的方法。本方法操作简单，普适性较好。
2、本专利技术所采用的技术方案如下：
3、(1)果实采集与外植体的获得
4、于花后30-60d采集梨果实，表面消毒后，将果实剖开，取出未成熟种子，挑开种皮，挤出未成熟合子胚作为外植体；
5、(2)以未成熟合子胚为外植体诱导体细胞胚发生
6、将步骤(1)获得的外植体接种于ph＝5.82的ms培养基上，置于25℃、黑暗下培养20-25d，由球形胚，经心形胚和鱼雷型胚发育过程，形成成熟体细胞胚，30-35d体细胞胚即可萌发形成再生芽；
7、(3)以未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织
8、将步骤(1)获得的外植体接种于ph＝5.82的ms培养基上，置于25℃、黑暗下培养，30d得到胚性愈伤组织；
9、(4)胚性愈伤组织的继代与胚性保持
10、将步骤(3)获得的胚性愈伤组织进行继代与增殖，在ph＝5.82的ms培养基上，置于25℃、黑暗下培养，保持愈伤组织胚性；
11、(5)胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生
12、将步骤(3)和(4)中获得的胚性愈伤组织转接到ph＝5.82的ms培养基上，置于25℃、黑暗下培养，诱导体细胞胚胎的形成与发育；
13、(6)再生植株的壮苗生根培养
14、将步骤(2)和(5)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于ph＝5.82的ms生根培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间16h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗；
15、(7)炼苗移栽。
16、进一步的，步骤(2)中ms培养基配方为：1.0-3.0mg/l naa，0.2-1.5mg/l tdz，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
17、进一步的，步骤(3)中ms培养基配方为：1.0-2.0mg/l 2,4-d，0.5-1.0mg/l kt或6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
18、进一步的，步骤(4)中ms培养基配方为：1.0-2.0mg/l 2,4-d，1.0mg/l 6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
19、进一步的，步骤(5)ms培养基配方为：含1.0-3.0mg/l naa，0.2-1.5mg/l tdz，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
20、进一步的，步骤(6)中ms生根培养基配方为：0.05-0.2mg/l iba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
21、进一步的，步骤(7)中具体步骤为：将步骤(6)获得的完整自根苗在温度为25℃的室内炼苗2-5d后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到蛭石：草碳为1:1的基质中，置于温度为25℃，光照强度1000lux，光照时间16h/d的培养箱中培养。
22、本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术以梨花后30-60d幼胚为外植体，可以在较短时间内(20-25d)诱导出体细胞胚胎并再生成植株；同时以梨花后30-60d幼胚为外植体，可诱导胚性愈伤组织并通过继代增殖保持愈伤组织胚性，将胚性愈伤组织转接到体细胞胚诱导培养基，即可诱导出体细胞胚胎并再生成植株；再生植株经生根培养后可正常移栽成活；
23、2)两种体细胞胚胎诱导途径再生效率高，可达100％，遗传稳定性好，普适性好，可以帮助在一定程度上提高梨遗传转化效率，增强转基因植株的遗传稳定性，降低转基因植株嵌合体的发生几率；
24、3)本专利技术使用naa和tdz在20-25d诱导出体细胞胚胎，30 -35d体细胞胚即可萌发形成再生芽，从外植体到再生植株的诱导时间较短，该技术可显著缩短梨无性系扩繁以及遗传转化的时间，提高效率；
25、4)本专利技术以未成熟胚为外植体，使用2,4-d诱导出胚性愈伤组织，同时筛选出合适的配方，可使胚性愈伤组织长期继代且不丢失胚性，最终利用已获得的体胚诱导配方从胚性愈伤中诱导出体细胞胚，该技术解决了使用胚作为外植体诱导植株再生时，需要每次操作都进行初代培养，且大量诱导时再生植株的遗传背景不统一的问题。
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1.一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(2)中MS培养基配方为：1.0-3.0mg/L NAA，0.2-1.5mg/L TDZ，30g/L蔗糖，7g/L琼脂。
3.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(3)中MS培养基配方为：1.0-2.0mg/L 2,4-D，0.5-1.0mg/L KT或6-BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂。
4.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(4)中MS培养基配方为：1.0-2.0mg/L 2,4-D，1.0mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂。
5.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(5)MS培养基配方为：含1.0-3.0mg/L NAA，0.2-1.5mg/L TDZ，30g/L蔗糖，7g/L琼脂。
6.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(6)中MS生根培养基配方为：0.05-0.2
7.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(7)中具体步骤为：将步骤(6)获得的完整自根苗在温度为25℃的室内炼苗2-5d后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到蛭石：草碳为1:1的基质中，置于温度为25℃，光照强度1000lux，光照时间16h/d的培养箱中培养。
...【技术特征摘要】
1.一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(2)中ms培养基配方为：1.0-3.0mg/l naa，0.2-1.5mg/l tdz，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
3.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(3)中ms培养基配方为：1.0-2.0mg/l 2,4-d，0.5-1.0mg/l kt或6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
4.如权利要求1所述的一种梨体细胞胚胎发生的方法，其特征在于：步骤(4)中ms培养基配方为：1.0-2.0mg/l 2,4-d，1.0mg/l 6-ba，30g/l蔗糖，7g/l琼脂。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨英杰，李雪萍，朱莹莹，王焕生，李鼎立，刘建龙，王然，崔振华，宋健坤，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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