【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，具体涉及一种荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇及其制备方法和在atp检测中的应用。
技术介绍
1、atp在生物体内是一种能量分子，在调节不同组织和器官的细胞内代谢和生化途径中扮演着重要角色。此外，atp为大多数生物体的生物化学反应提供能量，而且还作为局部缺血、低血糖症、帕金森病、阿尔茨海默病、缺氧和一些恶性肿瘤疾病潜在的标志物。因此，构建了多种类型的atp检测方法，有比色法、电化学分析方法、荧光分析方法和液相色谱分析方法等。但是，这些方法的缺点是耗时，且需要费时费力地修饰电极和荧光探针。近年来，我们根据两个荧光较弱的dna-ag ncs（或dna-cu/ag ncs）通过互补链靠近使得荧光增强的原理，构建了基于dna-ag ncs和dna-cu/ag ncs检测atp的荧光探针。这些探针虽然具有操作简单、高的灵敏性和选择性，但是一些性能参数如最低检测限仍不令人满意。因此非常迫切地需要建立一种性能更加优越的atp检测方法。
2、金属纳米簇（cu ncs, ag ncs和 au ncs）由几个到上百个原子组成，尺寸小于2nm, 由于其具有优异的水分散性、尺寸可调以及独特的光学性能，如离散能级、电子费米波长、高量子产率和良好的光稳定性，已经在荧光纳米探针方面的到应用。其中被dna保护的dna-ag ncs 与量子点和有机荧光团相比，更是具有低毒、生物相容性、可调节光的发射波长、大的stokes位移和容易合成等优点，被广泛应用于金属离子、小分子、酶、dna和蛋白质等的检测。
3、适
技术实现思路
1、本专利技术为解决利用荧光银纳米簇检测atp灵敏性低的缺点，提供了一种荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇及其制备方法和在atp检测中的应用；利用atp特异性识别的atp适配体为识别元件，dna-ag ncs为信号报告分子，建立的一种荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇。
2、本专利技术由如下技术方案实现的：一种荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇，所述荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇包括：atp、富c成核序列和富g序列的dna模板、pbs缓冲液，agno3和nabh4溶液；其中：所述dna模板的序列为：5´- cccttaatcccctttttaacctgggggagtattgcggaggaaggtttttgggtggggtgggg-3´，其中5´端前12个核苷酸序列为富c成核序列部分，中间第18-44个核苷酸序列为atp适配体，即atp特异性识别的寡核苷酸，3´端第50-62个核苷酸序列为富g序列部分；第13-17个和第45-49个核苷酸序列为atp适配体和富g序列以及富c成核序列的连接部分；
3、dna模板和atp的浓度分别为3 μm 和0-57 mm；
4、所述pbs缓冲液浓度为20 mm，ph = 7.0；
5、控制dna模板、agno3、nabh4的最终浓度比为1:6:6。
6、本专利技术还提供了制备所述荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇的方法，包括如下步骤：
7、（1）将dna寡核苷酸和20 mm 、ph = 7.0的pbs缓冲液混合，搅拌均匀；dna寡核苷酸的序列为：5´-cccttaatcccctttttaacctgggggagtattgcggaggaaggtttttgggtggggtgggg-3´；
8、（2）在步骤（1）所得溶液中加入agno3溶液混匀，4℃下避光反应20分钟，然后加入新制的nabh4溶液充分搅拌1分钟，在4℃下避光反应1小时，即得dna-ag ncs溶液；其中：dna模板、agno3、nabh4的最终浓度比为1:6:6。
9、进一步的，所述dna-ag ncs平均粒径约为2 nm。
10、本专利技术还提供了利用所述方法获得的荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇在atp检测中的应用，包括如下步骤：
11、（1）室温下在所述dna-ag ncs溶液中加入不同浓度的atp，测定不同浓度下样品溶液的荧光光谱，根据发射波的最大荧光强度绘制标准曲线；
12、（2）将待测样品液加入到所述dna-ag ncs溶液中，测定其荧光光谱，计算得到atp的浓度。
13、本专利技术所述dna模板，也称dna寡核苷酸，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列为：5´- ccc tta atc cccttt tta acctgggggagtattgcggaggaaggtttttgggtggggtgggg-3´，由62个碱基组成，其中5´端为富c成核序列部分（斜体字部分），中间为atp适配体部分（粗体字部分），即atp特异性识别的寡核苷酸，3´端为富g序列部分（红色字体部分），划线部分ttttt为atp适配体和富g序列以及富c成核序列的连接部分。
14、agno3溶液中的ag+和富c序列中的c碱基结合。nabh4把与c碱基结合的ag+还原为ag。
15、如图1所示，本专利技术的检测原理如下：dna模板包括位于5´端富c成核序列，中间的atp适配体部分和3´端富g序列部分。当加入atp时，由于atp对atp适配体具有很高的选择性和结合力，atp与atp适配体特异性结合促使其形成u型结构，使3´端的富g序列靠近荧光较弱的dna-ag ncs，导致其荧光显著增强，atp得到检测。
16、据报道当富g序列靠近荧光较弱的dna-ag ncs时，dna-ag ncs的荧光会显著增强。据此原理，本专利技术设计了荧光增强的g-rich-dna保护的银纳米簇及其在atp检测中的应用。其中g-rich-dna模板由位于5´端的成核富c序列、位于中间的atp适配体和3´ 端富g序列组成。当加入atp时，atp和其适配体特异性结合促使atp适配体的构象改变，导致3´ 端富g序列靠近荧光较弱的dna-ag ncs，结果dna-ag ncs的荧光显著增强，因此atp得到检测。该检测方法具有灵敏性高、操作方便、荧光增强且绿色环保的优点。
17、本专利技术以atp特异性识别的atp适配体为识别元件，通过设计dna模板，以dna-agncs为信号报告分子，可实现atp的检测，属于荧光增强型探针。在线性范围为18-54mm，atp的最低检测限为2.8μm，低于其他检测方法的最低检测限。本专利技术成本低廉、操作简单、灵敏度高、选择性强、毒性小、生物相容性好等特征，本专利技术所述的检测法为生物领域的atp检测提供了一种颇有前景的方法。
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1.一种荧光增强G-rich-DNA保护的银纳米簇，其特征在于：所述荧光增强G-rich-DNA保护的银纳米簇包括：ATP、富C成核序列和富G序列的DNA模板、PBS缓冲液，AgNO3和NaBH4溶液；其中：所述DNA模板的序列为：5´- cccttaatcccctttttaacctgggggagtattgcggaggaaggtttttgggtggggtgggg-3´，其中5´端前12个核苷酸序列为富C成核序列部分，中间第18-44个核苷酸序列为ATP适配体，即ATP特异性识别的寡核苷酸，3´端第50-62个核苷酸序列为富G序列部分；第13-17个和第45-49个核苷酸序列为ATP适配体和富G序列以及富C成核序列的连接部分；
2.制备权利要求1所述荧光增强G-rich-DNA保护的银纳米簇的方法，其特征在于：包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述DNA-Ag NCs平均粒径约为2 nm。
4.利用权利要求2所述方法获得的荧光增强G-rich-DNA保护的银纳米簇在ATP检测中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇，其特征在于：所述荧光增强g-rich-dna保护的银纳米簇包括：atp、富c成核序列和富g序列的dna模板、pbs缓冲液，agno3和nabh4溶液；其中：所述dna模板的序列为：5´- cccttaatcccctttttaacctgggggagtattgcggaggaaggtttttgggtggggtgggg-3´，其中5´端前12个核苷酸序列为富c成核序列部分，中间第18-44个核苷酸序列为atp适配体，即atp特异性识别的寡核苷酸，...
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