【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及一种基于液滴分选和磁性微球技术的dna标签文库构建方法。
技术介绍
1、随着分子生物学的迅速发展，测序技术进入了一个全新的阶段，标签技术在多个前沿测序领域中扮演着至关重要的角色，包括单细胞测序、时空转录组学、原位测序、可变剪接分析、染色质可及性测序、表观基因组测序、微生物组分析、病毒和病原体测序、单微生物测序以及单微生物跨物种跨组学测序。这些技术依赖于高分辨率和高精度的标签，以确保复杂样本和多样性数据的精确分析。
2、然而，传统的dna标签技术面临着重大瓶颈。现有方法的标签多样性通常仅为几百万种，在处理庞大样本量时，容易导致标签重复和碰撞的问题。例如，在单细胞测序中，标签重复可能导致数据混淆，影响细胞间异质性的解析；在病毒测序中，有限的标签多样性不足以应对大量病毒颗粒的标记，可能导致病毒变异和传播途径追踪的失误。要满足日益复杂和多样化的生物学研究需求，推动测序技术向更高水平迈进，亟需开发一种能够提供更高准确性和多样性的标签制作技术。
3、现有的主流单细胞测序dna标签制作技术通常通过在支撑载体上连接引物，随后通过引物退火形成双链dna，并对突出碱基末端进行磷酸化处理，最后利用连接酶将dna标签序列连接到磷酸化的末端。为增加标签多样性，这一过程通常重复2-4次，最终生成约380万种不同的dna标签，适用于多样化的单细胞测序需求。另一种传统方法是使用特异性dna序列作为模板，通过设计与模板配对的引物进行多轮pcr扩增，以延长dna标签并增加其种类多样性。
4、尽管这些技术在
5、1、标签多样性有限：尽管通过连接酶连接的方法可以增加多样性，但生成的标签种类仍然仅为约380万种，难以满足大规模单细胞分析的需求，容易导致数据冲突和重复。
6、2、操作复杂且耗时：这些方法都涉及复杂的操作，包括精确的温度控制和多步骤的化学处理，增加了操作的难度和时间成本。
7、3、标记精度不足：由于多次连接和退火过程中可能产生的误差，现有方法难以保证每个胶球上dna标签序列的唯一性和准确性。这在一定程度上限制了单细胞测序的分辨率和精度，影响了后续数据分析的准确性。
8、因此，开发一种新型的标签制作技术，以提高准确性、增加多样性并降低成本，已成为亟待解决的问题。这一技术将为当前和未来的生物学研究提供更强大的支持，推动测序技术迈向更高水平。
技术实现思路
1、为解决上述至少一个技术问题本申请提供了一种基于液滴分选和磁性微球技术的dna标签文库的构建方法，包括如下步骤：
2、1)合成dna标签模板序列片段，形成dna标签模板悬液a；
3、2)稀释步骤1)中的dna标签模板悬液a，形成稀释后的dna标签模板悬液b；
4、3)分别将悬液b、pcr扩增缓冲液、引物试剂及磁性微球溶液分成若干等份，分别取1份悬液b、1份pcr扩增缓冲液、1份引物试剂和1份磁性微球溶液进行混合后形成油包水液滴，直至形成若干个油包水液滴，将若干个油包水液滴分散在溶剂中，分别在不同的液滴内进行pcr反应，形成pcr扩增磁性微球反应液c，所述磁性微球用于捕获pcr扩增后生成的dna标签序列；
5、4)纯化反应液c得到dna标签文库。
6、所述若干等分需要根据带分离纯化的dna标签模板悬液b来确定，此处仅用于描述技术方案的操作过程，而非表达一个具体的数值，不构成对本申请技术方案的限制。
7、在本申请的一些技术方案中，上述步骤1)合成dna标签模板序列片段的方法可以采用本领域常见的合成方法进行合成，例如可以采用如下的方法进行合成：
8、首先利用固相合成技术合成包含指定引物序列和随机标签序列的dna片段。然后，通过液相反应提高产量，并进行纯化。最终，将合成的dna片段溶解形成dna标签模板悬液，以便于后续实验使用。
9、1、固相合成技术：在该工艺中，dna的每个核苷酸是逐步添加到一个固体基质(通常是微小的玻璃或塑料珠子)上。每一个添加步骤都会经过特定的化学反应，确保前一个核苷酸完全结合后，再进行下一步合成。这种方式能够严格控制反应条件，从而确保高保真度和低错误率。
10、2、液相合成结合：在固相合成基础上，液相反应用来增加合成的通量和效率。液相合成可以进行更复杂的化学反应，包括随机序列的合成。它在较大规模上合成短的dna片段(比如b部分的随机序列)时非常有效。通过结合固相与液相的优势，平台可以实现高通量和定制化的dna合成，生成包含特定a、b、c结构的多样性序列。
11、3、随机序列的生成：对于b部分的随机标签序列，可以通过液相合成中的“多样化碱基混合物”技术来实现。具体来说，合成过程中会使用混合的核苷酸，以确保生成的dna片段在b部分具有随机性。同时，这些平台合成方法也能调节随机序列的长度和碱基比例，从而满足特定的实验要求。
12、4、高通量并行合成：合成平台能够并行合成数百万条不同的dna序列，且这些合成过程通常是自动化的。现代平台使用机器人操作和计算机控制来处理样品，极大提高了效率，保证了每条dna序列的合成质量和准确性。
13、通过上述标签模板的合成方法，随机序列的多样性理论上可达到4的n次方，n表示标签的碱基数量，最终合成的标签数量可达到亿万级以上，相比传统的标签生成方法，大大丰富了标签的多样性，能够适应多样化的单细胞测序需求。
14、在本申请的一些技术方案中，所述步骤3)中的pcr扩增缓冲液包含核酸染料。
15、在本申请的一些技术方案中，所述核酸染料选自sybr green、syto-13、syto-82和sybr gold。
16、核酸染料与双链dna结合紧密，但在单链状态下几乎不结合。在液滴pcr结束后，目标标签以双链形式存在，其中一条链通过特定标记与磁性微球相连，另一条互补链未连接至磁性微球。在分选和纯化过程中，液滴经破油处理后，双链dna解链退火，一条与磁性微球连接的dna链保留下来，另一条互补链以及未结合的引物和核酸染料等杂质被彻底清洗。最终，获得的是连接在磁性微球上的单链dna标签。
17、这样经过分离纯化后，目标dna链将保持较高的纯度，确保后续实验的准确性和可靠性。
18、在本申请的一些技术方案中，所述步骤3)中的引物试剂包含荧光基团。
19、在本申请的一些技术方案中，所述步骤3)中的荧光基团选自taqman探针。
20、在本申请的一些技术方案中，所述taqman探针上的荧光报告基团选自fam、vic、hex、tet、joe、rox、cy3和cy5，荧光淬灭基团选自bhq和tamra。
21、taqman探针包含两个荧光染料和一个淬灭剂，通常位于探针的两端。在探针未被切割时，荧光染料和淬灭剂之间的距离很近，导致淬灭剂吸收荧光染料发出的荧光，使得信号几乎本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于液滴分选和磁性微球技术的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中的PCR扩增缓冲液包含核酸染料，或者所述步骤3)中的引物试剂包含荧光基团。
3.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA标签模板序列片段包含a、b和c三个部分，所述a部分为包含6-30个碱基的上游引物配对序列，所述b部分为包含15-20个碱基的随机DNA标签序列，所述c部分为包含6-30个碱基的下游引物配对序列。
4.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中的稀释原则为使得生成的所有液滴中，包含有DNA标签模板序列片段的液滴满足泊松分布λ＝0.01～0.6。
5.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中的磁性微球表面修饰了与c部分相同的序列。
6.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中的引物试剂包含上游引物a1和下游引物c
7.根据权利要求6所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述上游引物a1和下游引物c1的摩尔浓度比为1～50:1。
8.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中的形成若干个油包水液滴的方法包括如下步骤：
9.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中的纯化方法包括进行荧光识别和磁性吸附。
10.根据权利要求1所述的DNA标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中的纯化方法包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种基于液滴分选和磁性微球技术的dna标签文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的dna标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中的pcr扩增缓冲液包含核酸染料，或者所述步骤3)中的引物试剂包含荧光基团。
3.根据权利要求1所述的dna标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中的dna标签模板序列片段包含a、b和c三个部分，所述a部分为包含6-30个碱基的上游引物配对序列，所述b部分为包含15-20个碱基的随机dna标签序列，所述c部分为包含6-30个碱基的下游引物配对序列。
4.根据权利要求1所述的dna标签文库的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中的稀释原则为使得生成的所有液滴中，包含有dna标签模板序列片段的液滴满足泊松分布λ＝0.01～0.6。
5.根据权利要求1所述的dna标签文库的构建方法，其特征在于，所...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。