【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成，具体的，涉及一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法。
技术介绍
1、l-2-氨基己二酸作为一种非蛋白质氨基酸，具有的广泛用途，是合成β-内酰胺类抗生素青霉素和头孢菌素前体的重要手性砌块，是广谱合成药物的中间体，可用于治疗风湿病、银屑病和前列腺癌等，同时还可作为合成某些特殊化学物质的中间体，如甜味剂、多肽及螯合剂等，l-2-氨基己二酸在医药、化工、食品、饲料等领域市场潜力巨大，但现今l-2-氨基己二酸的供应不能满足市场需求。而l-2-氨基己二酸-δ-半醛作为合成l-2-氨基己二酸的重要前体，其主要来源于化学合成，但此方法存在生产路线长、原料成本高、反应条件苛刻、收率不理想、污染环境等缺点。
2、利用生物催化或生物转化法制备l-2-氨基己二酸具有条件温和，成本较低，环境污染较少等优势，但起步较晚，没有形成工业化生产的工艺。日本美露香公司筛选到产碱杆菌、假单胞菌、库特氏菌可将底物l-六氢吡啶羧酸合成l-2-氨基己二酸。以赖氨酸为底物筛选到农杆菌、产碱杆菌、短杆菌、芽孢杆菌可合成l-2-氨基己二酸。前者底物价格昂贵，后者反应效率极低，均不适宜工业化生产。kuniho nakata等人筛选到一株黄杆菌，通过微生物培养可直接一步将赖氨酸上的氨基甲基转化成羧基，且不用修饰α位置上的氨基，但转化效率仅为25%。因此，本专利技术开发一种环保、高效的l-2-氨基己二酸-δ-半醛制备方法，以满足l-2-氨基己二酸的合成及应用。
技术实现思路
1、本专利技术提出一种
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提出一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，包括以下步骤：
4、以l-赖氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨酶和辅因子催化反应，得到l-2-氨基己二酸-δ-半醛；
5、所述转氨酶为l-赖氨酸6-氨基转移酶、l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体中的一种；
6、所述l-赖氨酸6-氨基转移酶来源于韩国寡养单胞菌（ stenotrophomonas koreensis），氨基酸序列如seq id no.2所示；
7、所述限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。
8、作为进一步的技术方案，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的氨基酸序列如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq id no.16、seq id no.18、seq id no.20、seq id no.22或seq id no.24所示，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体与所述l-赖氨酸6-氨基转移酶相比，存在如下突变中的至少一种：q71k、n76l、g212a、r213g。
9、作为进一步的技术方案，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的编码基因的序列为seq idno.1或保有功能且编码相同蛋白的定点诱变序列。
10、作为进一步的技术方案，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的编码基因序列为seqid no.3、seqid no.5、seqid no.7、seqid no.9、seqid no.11、seqid no.13、seqidno.15、seqid no.17、seqid no.19、seqid no.21、seqid no.23中任一种。
11、作为进一步的技术方案，所述转氨酶的添加形式包括粗酶液或全细胞。
12、作为进一步的技术方案，所述粗酶液的制备方法，包括以下步骤：在宿主细胞中表达所述l-赖氨酸6-氨基转移酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液。
13、作为进一步的技术方案，所述全细胞的制备方法，包括以下步骤：在宿主细胞中表达所述l-赖氨酸6-氨基转移酶，得到的重组细胞为全细胞。
14、作为进一步的技术方案，所述重组细胞的制备方法，包括以下步骤：向所述宿主细胞导入能够表达所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的所述重组细胞。
15、作为进一步的技术方案，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的核酸分子通过重组载体导入到宿主细胞。
16、作为进一步的技术方案，所述宿主细胞为原核细胞。
17、作为进一步的技术方案，所述原核细胞为细菌。
18、作为进一步的技术方案，所述细菌为大肠杆菌，具体为e.coli bl21 (de3)。
19、作为进一步的技术方案，所述重组载体为携带有所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的编码基因的细菌质粒。
20、作为进一步的技术方案，所述重组载体具体为将所述l-赖氨酸6-氨基转移酶或l-赖氨酸6-氨基转移酶突变体的编码基因替换pet-28a(+)载体的酶切位点bamh ι和xho i之间的小片段后得到的重组质粒。
21、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液时，所述转氨酶在催化反应体系中的浓度为0.1~5g/l。
22、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液时，所述转氨酶在催化反应体系中的浓度为0.2g/l。
23、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为全细胞时，所述转氨酶在催化反应体系中的湿重为10~50g/l。
24、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为全细胞时，所述转氨酶在催化反应体系中的湿重为25g/l。
25、作为进一步的技术方案，所述催化反应在浓度为50~100mm，ph值为6.5~8.5的磷酸盐缓冲液中进行。
26、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液时，催化反应在浓度为50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲液中进行。
27、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为全细胞时，催化反应在浓度为50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲液中进行。
28、作为进一步的技术方案，所述催化反应的温度为10~30℃，催化反应的时间为12~24h。
29、作为进一步的技术方案，所述催化反应的温度为15℃，催化反应的时间为12h。
30、作为进一步的技术方案，所述催化反应还加入辅因子，所述辅因子为5-磷酸吡哆醛。
31、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液或全细胞时，所述5-磷酸吡哆醛在催化反应体系中的浓度为0.1~1mm。
32、作为进一步的技术方案，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液或全细胞时，所述5-磷酸吡哆醛在催化反应体系中的浓度为0.4mm。
33、本专利技术的工作原理及有益效果为：
34、本专利技术中，利用生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.22或SEQ ID No.24所示，所述L-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体与所述L-赖氨酸6-氨基转移酶相比，存在如下突变中的至少一种：Q71K、N76L、G212A、R213G。
3. 根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-赖氨酸6-氨基转移酶的编码基因的序列为SEQ ID No.1或保有功能且编码相同蛋白的定点诱变序列。
4. 根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述L-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的编码基因序列为
5.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述转氨酶的添加形式包括粗酶液或全细胞。
6.根据权利要求5所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，当所述转氨酶的添加形式为粗酶液时，所述转氨酶在催化反应体系中的浓度为0.1~5g/L。
7.根据权利要求5所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，当所述转氨酶的添加形式为全细胞时，所述转氨酶在催化反应体系中的湿重为10~50g/L。
8.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反应在浓度为50~100mM，pH值为6.5~8.5的磷酸盐缓冲液中进行。
9.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反应的温度为10~30℃，催化反应的时间为12~24h。
10.根据权利要求1所述的一种L-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述催化反应还加入辅因子，所述辅因子为5-磷酸吡哆醛。
...【技术特征摘要】
1.一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的氨基酸序列如seq id no.4、seq id no.6、seq idno.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq id no.16、seq id no.18、seq idno.20、seq id no.22或seq id no.24所示，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体与所述l-赖氨酸6-氨基转移酶相比，存在如下突变中的至少一种：q71k、n76l、g212a、r213g。
3. 根据权利要求1所述的一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的编码基因的序列为seq id no.1或保有功能且编码相同蛋白的定点诱变序列。
4. 根据权利要求1所述的一种l-2-氨基己二酸-δ-半醛的合成方法，其特征在于，所述l-赖氨酸6-氨基转移酶的突变体的编码基因序列为seqid no.3、seqid no.5、seqid no.7、seqid no.9、seqid no.11、seqid ...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋聪，贾振华，张翔，李冉，赵芊，刘昆昂，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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